Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren
Summary
Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.
Abstract
Erhöhung der Beweis zeigt an, dass die normale Blutbildung durch ausgeprägte microenvironmental Hinweise in der BM reguliert wird, darunter spezialisierte zelluläre Nischen modulierende kritische hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Funktionen1,2. In der Tat zeichnet sich ein genaueres Bild von der hämatopoetische Mikroumgebung jetzt bei dem bilden der endosteal und die endothelialen Nischen Funktionseinheiten für die Regulierung des normalen HSC und ihre Nachkommen3,4,5, . Neue Studien haben die Bedeutung der perivaskuläre, Adipozyten und neuronalen Zellen bei der Erhaltung und Regulierung der HSC Funktion6,7,8gezeigt. Darüber hinaus gibt es Beweise, dass Zellen aus verschiedenen Linien, d.h. myeloischen und lymphatischen Zellen, Haus und wohnen in speziellen Nischen innerhalb der BM Mikroumgebung. Allerdings ist eine vollständige Zuordnung der BM Mikroumgebung und seine Bewohner noch im Gange.
Transgenen Mausstämme Linie bestimmte fluoreszierende Markierungen oder Mäuse, die genetisch ausgeführt, um ausgewählte Moleküle in bestimmten Zellen der BM Nische fehlt auszudrücken sind jetzt verfügbar. Knock Out und Abstammung tracking-Modelle in Kombination mit Transplantation Ansätze bieten die Möglichkeit, das Wissen über die Rolle der spezifischen “Nische” zu verfeinern Zellen für definierte hämatopoetischen Bevölkerungen, wie HSC, B-Zellen, T-Zellen, myeloische Zellen und erythroiden Zellen. Diese Strategie kann weiter durch die Zusammenlegung des Einsatz von zwei-Photonen-Mikroskopie von den Calvarium verstärkt werden. Indem in Vivo hochauflösende Bildgebung und 3-d-Rendering von BM Calvarium, können wir jetzt genau die Position bestimmen, wo bestimmte hämatopoetische Teilmengen in BM zu Hause und die Kinetik der ihre Expansion im Laufe der Zeit zu bewerten. Hier werden Lys-GFP transgene Mäuse (Markierung myeloische Zellen)9 und RBPJ Knock-out-Mäusen (fehlender kanonische Notch signaling)10 in Kombination mit IVFM zur Engraftment myeloische Zellen eine Kerbe defekt BM Mikroumgebung zu bestimmen.
Introduction
Intravitalen multiphoton Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das ermöglicht die hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung von Geweben mit Tiefe bis zu 1mm, je nach Gewebe. Bei der Anwendung auf die Maus Calvarium ermöglicht es, beobachtet das Verhalten der hämatopoetischen Zellen innerhalb der BM in eine nicht-invasive Weise bis zu 60-100 μm11. Dieser Ansatz dient hier die Kinetik des Engraftment des normalen myeloische Vorfahren in den BM RBPJ Knock-out-Mäusen fehlt kanonische Kerbe Signalisierung zu bestimmen.
Neuere Arbeiten aus unserer Gruppe zeigten, dass Defekte kanonische Kerbe Signalisierung BM Mikroumgebung, führe zu einer myeloproliferative-ähnliche Erkrankung12. Verlust der Notch signaling erhielten bedingte Löschung der DNA-bindende Domäne der RBPJ, der kritischen Transkriptionsfaktor flussabwärts der kanonischen Kerbe Signalisierung mit Mx1-Cre Rekombination10induziert. In dieser Studie wurde die Mx1-Cre/RBPJLox/Lox Mäusen Modell verwendet. Bedingte Löschung des Motivs DNA-Bindung des RBPJ führt zum Verlust der Signalisierung von allen Notch Rezeptoren. In der Mx1-Cre-Modell, Cre Ausdruck durch den Mx1-Projektträger bei der Verabreichung von PolyI:C, wodurch die Induktion der gezielte gen Löschung in den Blutkörperchen sowie Stromazellen Komponenten mehrerer Organe aktiviert angetrieben wird einschließlich BM, Milz und Leber.
Mx1-Cre+/RBPJLox/Lox und Mx1-Cre–/RBPJLox/Lox Mäusen mit PolyI:C (hereon gekennzeichnet als RBPJKO und RBPJWT, beziehungsweise) induziert wurden tödlich bestrahlt und mit normalen, Wildtyp hämatopoetischen Zellen transplantiert. Ab 4. Woche nach der Transplantation, entwickelt RBPJKO Empfänger deutliche Leukozytose gefolgt von Splenomegalie. Obwohl RBPJKO Mäuse zunehmenden Anteils myeloischer Vorläuferzellen in der BM 8. Woche nach Transplantation und zu späteren Zeitpunkten vorgestellt, offenbart Analyse des BM 4 und 6 Wochen nicht auffällige Unterschiede inhaltlich myeloische Zellen im Vergleich zur Kontrolle RBPJWT Empfänger. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass Mx1-Cre in verschiedenen blutbildenden Organe exprimiert wird die Frage aufgeworfen, ob die BM Mikroumgebung direkten Einfluss auf die Einleitung der myeloproliferative Phänotyp hatten.
Um festzustellen, ob der BM eine kritische erste Website der Krankheitsentwicklung war, wurde IVFM von der Maus Calvarium in Kombination mit BM-Transplantation (BMT), RBPJ-Knock-Out-Modell und eine Linie tracking-System verwendet. Transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck EGFP unter der Kontrolle der spezifischen Lysozym Promotor (Lys-GFP)9 wurden verwendet, um die Spenderzellen zu erhalten, die bei BM imaging nach BMT visualisiert werden können. Lysozym Ausdruck ist spezifisch für myeloische Zellen und Lys-GFP markiert Zellen aus der gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP) zur Reife Granulozyten13.
IVFM des BM zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezeigt, dass Lys-GFP Zellen ebenso an die BM der RBPJWT und RBPJKO Empfänger vernetzten, aber erweitert und schneller in der BM RBPJKO Empfänger aufgeprägt. Dieser Unterschied war dramatisch zum früheren Zeitpunkt (Woche 2) und verringerte sich im Laufe der Zeit (Wochen 4 und 6). Jedoch zu dieser späteren Zeitpunkten, Bewertung von hämatopoetischen Fach in den gleichen Empfänger zeigte eine stetige Zunahme der Zahl der myeloischen Zellen zirkulieren in der PB und lokalisiert in der Milz von Mäusen, RBPJKO, zeigt eine erhöhte Leistung von Zellen aus dem BM in den Blutkreislauf. Lys-GFP Zellen Lokalisierung in der BM von transplantierten Mäusen bei 6 Wochen ergab, dass myeloische Zellen weiter das Gefäßsystem in der Mikroumgebung RBPJKO als im Steuerelement wohnen würden.
Kollektiv, Einblicke die Kombination von IVFM mit dieser bestimmten Tiermodellen in der Engraftment Dynamik der myeloischen Zellen in die RBPJKO BM Mikroumgebung. Die Versuchsplanung und quantitative der hier beschriebene Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Paradigma, die angewendet werden kann, um ähnliche Fragen beantworten. Beispielsweise gestatten die Verwendung der anderen Zelle spezifische Linie tracking-Modelle, wie RAG1-GFP14 oder Gata1-GFP15 Mäuse, im Anschluss an das Verhalten des lymphatischen oder erythroiden Vorläuferzellen, bzw. in dem BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Design so optimiert, dass die Kinetik der blutbildenden Zellen Engraftment studieren von fluoreszierendem intravitalen Mikroskopie. In dieser Studie wurde der Ausbau der myeloischen Vorläuferzellen in einer WT-BM oder in eine Kerbe, die Signalisierung defekt BM in den Knochen Calvarium von folgenden Lys-GFP positive myeloische Zellen nach BMT in RBPJWT oder RBPJKO Empfänger verfolgt. Dieser Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Modell, das auf ähnliche Fragen, zum Beispiel …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bildgebung erfolgte im Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie an der Indiana University, unter der Regie von Dr. Ken Dunn. Das stereotaxischen Gerät ist ein Prototyp entworfen und hergestellt von Mark Soonpaa, Brunnen-Zentrum für pädiatrische Forschung. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Research Foundation (NC) und die CTSI kollaborative Projekt IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
Referências
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