La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo
Summary
Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l’homing e l’attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).
Abstract
La prova aumentante indica che ematopoiesi normale è regolata da stimoli microambientali distinti in BM, sono specializzati nicchie cellulare modulazione critica di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni1,2. Infatti, un quadro più dettagliato del microambiente ematopoietico ora sta emergendo, in cui l’endostali e le nicchie endoteliali formano unità funzionali per la regolazione del normale HSC e loro progenie3,4,5 . Nuovi studi hanno rivelato l’importanza delle cellule perivascolari, adipociti e cellule neuronali nel mantenimento e regolamentare HSC funzione6,7,8. Inoltre, c’è prova che le cellule da stirpi differenti, vale a dire le cellule mieloidi e linfoidi, casa e risiede in nicchie specifiche all’interno del microambiente di BM. Tuttavia, una mappatura completa del microambiente BM e dei suoi occupanti è ancora in corso.
Diversi ceppi di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti specifico lignaggio o topi geneticamente per mancanza di molecole selezionate in specifiche cellule della nicchia BM sono ora disponibili. Knock-out e lignaggio rilevamento modelli, in combinazione con approcci di trapianto, offrono la possibilità di perfezionare le conoscenze sul ruolo di specifici “di nicchia” cellule per popolazioni ematopoietiche definite, ad esempio HSC, B-cellule, cellule T, cellule mieloidi e cellule eritroidi. Questa strategia può essere ulteriormente rafforzata unendo l’uso di microscopia del due-fotone del calvarium. Fornendo in vivo imaging ad alta risoluzione e rendering 3D del calvarium BM, possiamo ora determinare precisamente la posizione dove specifici sottoinsiemi ematopoietiche home in BM e valutare la cinetica della loro espansione nel corso del tempo. Qui, Lys-GFP topi transgenici (marcatura cellule mieloidi)9 e RBPJ topi knock-out (carente canonico tacca di segnalazione)10 sono utilizzati in combinazione con IVFM per determinare l’attecchimento di cellule mieloidi ad un microambiente BM difettoso di tacca.
Introduction
Microscopia di fluorescenza multifotonica videomicroscopia (IVFM) è una potente tecnica di imaging che permette ad alta risoluzione, in tempo reale immagini di tessuti con profondità fino a 1mm, a seconda del tessuto. Quando applicato al calvarium del mouse, permette di osservare il comportamento delle cellule ematopoietiche all’interno il BM in maniera non invasiva fino a 60-100 μm11. Questo approccio è usato qui per determinare la cinetica di attecchimento dei progenitori mieloidi normali nei topi knock-out BM di RBPJ carente canonico tacca di segnalazione.
Recenti lavori del nostro gruppo ha dimostrato quello difettoso canonico tacca di segnalazione nel BM microambiente porta a una malattia mieloproliferativa simil-12. Perdita della tacca di segnalazione è stata ottenuta tramite l’omissione condizionale del dominio obbligatorio del DNA di RBPJ, il fattore di trascrizione critica a valle del canonico tacca di segnalazione, utilizzando Mx1-Cre indotto ricombinazione10. In questo studio, è stato utilizzato il modello di topilox/lox Mx1-Cre/RBPJ. Eliminazione condizionale del motivo DNA-legante di RBPJ provoca la perdita del segnale da tutti i recettori di tacca. Nel modello Mx1-Cre, Cre espressione è guidata dal promotore Mx1 attivato in seguito a somministrazione di polyI:C con conseguente induzione di delezione genica mirata nelle cellule di sangue così come componenti stromal degli organi multipli, compreso BM, milza e fegato.
MX1-Cre+/RBPJlox/lox e Mx1-Cre–/RBPJlox/lox topi indotti con polyI:C (hereon indicato come RBPJKO e RBPJWT, rispettivamente) sono stati irradiati letalmente e trapiantati con cellule ematopoietiche normali, wild-type. A partire dalla settimana 4 dopo il trapianto, i destinatari RBPJKO sviluppato la leucocitosi significativa seguita da splenomegalia. Anche se topi RBPJKO presentato percentuale aumentata dei progenitori mieloidi in BM alla settimana 8 dopo trapianto e intervalli di tempo più tardi, analisi di BM alle settimane 4 e 6 non ha rivelato differenze evidenti nel loro contenuto delle cellule mieloidi rispetto al controllo RBPJWT destinatari. Questa osservazione, insieme al fatto che Mx1-Cre è espresso in diversi organi ematopoietici, ha sollevato la questione se il microambiente BM avuto impatto diretto sull’inizio del fenotipo mieloproliferativa.
Per stabilire se il BM è un sito critico iniziale di sviluppo della malattia, IVFM del calvarium del mouse è stato usato in combinazione con BM trapianto (BMT), il modello knock-out RBPJ e un sistema di tracciamento di lignaggio. Topi transgenici che esprimono EGFP sotto il controllo del promotore (Lys-GFP) lisozima specifico9 sono stati utilizzati per ottenere le cellule erogarici che potrebbero essere visualizzate durante BM imaging dopo BMT. Espressione di lisozima è specifico di cellule mieloidi e Lys-GFP segna celle dal comune progenitore mieloide (CMP) per i granulociti maturi13.
IVFM del BM in diversi momenti ha dimostrato che cellule di Lys-GFP homed similmente ai destinatari BM di RBPJWT e RBPJKO, ma ampliato e innestate più velocemente nei destinatari del BM di RBPJKO. Questa differenza era drammatica al punto precedente di tempo (settimana 2) ed è diminuito nel tempo (settimane 4 e 6). Tuttavia, questi intervalli di tempo più tardi, valutazione del compartimento ematopoietico in stesso destinatario ha mostrato un aumento costante del numero di cellule mieloidi circolanti nel PB e localizzato nella milza dei topi RBPJKO, che indica un’uscita aumentata delle cellule da BM nella circolazione. Analisi della localizzazione di cellule Lys-GFP in BM di topi trapiantati a 6 settimane ha rivelato che le cellule mieloidi risiedevano più lontano del sistema vascolare nel microambiente RBPJKO che nel controllo.
Collettivamente, la combinazione di IVFM con questi specifici modelli animali fornito le comprensioni nella dinamica attecchimento delle cellule mieloidi nel microambiente RBPJKO BM. Il disegno sperimentale e l’approccio quantitativo descritto qui è proposto come un paradigma che possa essere applicato per affrontare simili questioni. Ad esempio, può consentire l’uso di altri stirpe specifico cellulare rilevamento modelli, ad esempio RAG1-GFP14 o Gata1-GFP15 topi, seguendo il comportamento di linfoide o progenitori eritroidi, rispettivamente, in BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un disegno sperimentale ottimizzato per studiare la cinetica di attecchimento di cellule ematopoietiche da microscopia di fluorescenza Intravital. In questo studio, l’espansione di cellule progenitrici mieloidi in un BM WT o in una tacca di segnalazione difettosa BM è stato registrato in calvarium osseo dalle cellule mieloidi positive di Lys-GFP seguente dopo BMT in destinatari RBPJWT o RBPJKO. Questo approccio è proposto come un modello che può essere applicato per affrontare simili questio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La formazione immagine è stata effettuata nel centro Indiana per microscopia biologica presso l’Indiana University, diretto da Dr. Ken Dunn. Il dispositivo stereotassica è un prototipo progettato e realizzato da Mark Soonpaa, Wells Center per la ricerca pediatrica. Questo lavoro è stato supportato da NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN research Foundation (NC) e la collaborazione di CTSI progetto IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
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