Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Ангиогенез инициируется внеклеточных сигнальных сигналов, которые способствуют эндотелиальные клетки (ЭКС) поляризовать, мигрируют с направленной специфичностью, и формируют новую сосудистую сеть в тканях, которые требуют кровоснабжение. Предрасполагающими факторами думали управлять ангиогенез являются сигналы от внеклеточного матрикса (ECM). В ответ на физические сигналы, КЭ расширить новые ветви с направленной специфичностью для направления направленного движения в формировании сосудистой сети 1,2. Архитектура морфологии EC и разветвленности определяется локализованной регуляции микротрубочек (МТ) цитоскелета способом , который согласовывается с регулированием ACTO-миозина сократительной 3. Для того , чтобы ветви ЕС для формирования, миозина-II должен быть локально подавлена, что приводит к локализованным мембранных выступов 4. В то же время и в том же месте внутри клетки, динамика роста МТ модифицируются в результате медленного и устойчивого роста МТ для содействия филиал Элондование и стабильность 5. Это скоординированы цитоскелета регулирование позволяет КЭ поляризовать их морфологии, чтобы облегчить направленную миграцию.
Развитие поляризованного клеточной морфологии требует поляризованного МТ узел 6. При переносе эпителиальные клетки, МЦ медленно и настойчиво специально растут на переднем крае клетки 7-9; в то время как в нейронах, инициирование и удлинение аксонов или дендритов требует , чтобы МЦ не только присутствуют, но они динамически происходят процессы сборки и разборки 10-15. Таким образом, локализованный контроль динамики роста МТ определяет архитектуру клетки и позволяет быстро ремоделирования морфологии клеток, как КЭ перемещаться по их ECM.
динамика роста МТ регулируются семейства молекулярных моторных белков и немоторных белков, называемых микротрубочек белков, ассоциированных или микротрубочек взаимодействующих белков (далее REFErred как MAPS). Карты могут быть локально активироваться или инактивируется, как правило , через сигнальные каскады , инициированные на границе соты ECM 16,17. После того, как активная функция, Картах путем связывания с МТ и изменения кинетики сборки и разборки МТ; таким образом , функционирует локально регулировать динамику МТ с целью продвижения формы клеток и полярность 18-20. Митотическое Центромера Associated Kinesin (MCAK) представляет собой семейство MAP Kinesin-13 , который связывается с МТ концами и пар АТФ гидролиза М. Т. разборке 21-23. Эта функциональная роль MCAK , как известно, решающее значение в пределах митотического веретена 24-28, а также во время интерфазы 29,30. В межфазной КЧС, MCAK опосредованной MT разборки регулируется локализованной Aurora-A индуцированного фосфорилирования MCAK в ответ на рану краем индуцированной активации Rac1 небольшой GTPase. Результатом этого сигнального каскада является ингибирование MCAK на переднем крае КЭ, что приводит к росту поляризованного МТ в направлении леADING край и MCAK индуцированный MT разборку на заднем крае мигрирующих ECs 31.
Традиционные методики измерения динамики роста МТ, как правило, используется отслеживание рук либо флуоресцентно меченных тубулина или, совсем недавно, флуоресцентно меченных MT Конец Связывание белка 1 или 3 (EB1 или EB3, соответственно). Флуоресцентные тубулина подход имеет преимущество маркировки весь массив МТ. Тем не менее, так как большинство митотических типов клеток поддерживать радиальный массив МЦ во время интерфазы 8,32,33, МЦ возле центросоме очень плотные, и в результате, отслеживание роста МТ и разборку с флуоресцентным тубулина обычно ограничивается периферическое регионы клетки. Из-за этих ограничений, использование флуоресцентно-меченых белков (EB EB1 или EB3) был более общий подход к измерению динамики MT. Поскольку ЭТ только знак растущих плюс концы МЦ, они отображаются в виде мелких (1-3 мкм), ярко флуоресцентный приходятTS, обеспечивая тем самым легко различимой маркер полимеризации MT с очень ограниченным фоновой флуоресценции 34-37. Хотя тот факт, что ЭТ метка только подмножество массива MT представляет собой большую прочность подхода EB, он также подчеркивает одно важное ограничение, что невегетационный МЦ не помечены EB3 подхода. Тем не менее, способность измерять и отслеживать EB3 комет с течением времени и визуализировать рост МТ в рамках субклеточном регионов делают этот подход идеальным решением для приложений, требующих региональной оценки организации МТ.
Другим важным ограничением традиционных методик для измерения динамики роста МТ была очень большие наборы данных и время, необходимое для анализа данных. Это ограничение связано с необходимостью ручного отслеживания сотен EB комет с высоким временным разрешением. Кроме того, эти измерения должны быть сделаны в статистически значимом количестве клеток, а также осуществляется под различными контроля и experimental условия. В последнее время эти ограничения были преодолены с помощью вычислительных методов анализа , специально направленных на отслеживание EB3 комет с помощью покадровой микроскопии в живых клетках 35. При правильном использовании, этот вычислительный подход служит как ограничить вероятность возникновения ошибки человека, связанного с ручным слежения в дополнение к предоставлению для метода с высокой пропускной способностью измерения полимеризации МТ. Компьютерный анализ динамики МТ с использованием программного пакета MatLab на основе, plusTipTracker, позволяет для измерения роста МТ путем отслеживания флуоресцентно-меченых EB3 кометы 5,31,35,38. Кроме того, программное обеспечение plusTipTracker позволяет для расчетов MT катастрофических событий (он же разборке) на основе исчезновения EB3 комет в пределах растущей дорожки MT, и позволяет субклеточном ( так называемый региональный) анализ динамики роста МТ в определенных пользователем регионах , представляющих интерес , Для наших исследований, динамика роста МТ сравнивали в пределахразветвленными регионов по сравнению с неразветвленных регионах, или в пределах ведущего по сравнению с задней кромок ячеек. Вывод данных из программного обеспечения plusTipTracker также могут быть использованы для создания цветовой кодировкой дорожки наложений для отдельных клеток и субклеточных регионах.
Здесь мы опишем методологию, используемую для изучения роли MCAK в модуляции динамики роста МТ и вклад этого MT depolymerase к регулированию ЕС ветвящегося морфологию и направленную миграцию. Наш подход используется первичной линии клеток человека, пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs), которые легко культивировать и высоко поддаются электропорации-индуцированной, временной трансфекции плазмиды кДНК. Затем мы использовали с высокой разрешающей способностью, замедленная флуоресценция микроскопия HUVECs трансфицированных MT-Энд-связывающим белком 3 (EB3) и Митотическое Центромера Associated Kinesin (MCAK) Определённые кДНК конструкции для оценки влияния на динамику МТ трансфицировали HUVECs. компьютерный анализ изображения PlusTipTracker основе из EB3меченных MT плюс концы в том, чтобы измерить скорость роста МТ и времена жизни роста МТ в покадровой изображений, для измерения и сравнения влияния экспериментальных манипуляций на динамику роста МТ. Данная методика позволяет при изучении динамики МТ и идентификации как локализованный регулирование динамики МТ в субклеточных регионах вносит свой вклад в развитие кровеносных сосудов процессов ЕС ветвления и миграции. Эти методы применимы к исследованию любой MAP, которые могут быть флуоресцентно меченных и выраженных в живых клетках.
Использование HUVECs в морфологии и миграции экспериментов.
Live-ячейки изображения динамики роста МТ EB3-меченных в пределах HUVECs требует соответствующих и воспроизводимые условия культивирования клеток для того, чтобы измерить и оценить изменения в росте MT и HUVEC морфологии, таким образом, что они затем могут быть назначены ЕСМ сигнализации кия. HUVECs представляют собой прекрасную модель для изучения формы и подвижность клеток. Они высоко поддаются трансфекции с флуоресцентно-меченых кДНК, они демонстрируют драматические морфологию в ответ как растворимых , так и физические сигналы сигнализации, и они сохраняют способность организовать себя в сосудистых трубок при условии соответствующих условий культивирования клеток 65-70. Первичные клеточные культуры, такие как HUVECs, требуют бережного обращения и контроля за номер сотового канала для того, чтобы обеспечить клетки здоровы, и что они будут вести себя нормально во время экспериментов. Например, при проведении экспериментов по исследованию cytoskeleт и / или морфологии клеток, HUVECs не должна использоваться для проведения экспериментов за пределами десятой клеточной культуры прохода, а HUVECs обычно начинают показывать неравномерные морфологию вокруг прохода двенадцати до пятнадцати.
Плотность клеток также является важным регулятором здоровья HUVEC и пролиферации. HUVEC ветвящиеся исследования (см протокол 10.1-10.4 выше) используют культуры относительно низкой плотности клеток, с тем чтобы обеспечить ячеек физического пространства для взаимодействия с их ECM и расширить разветвленные выступы. В противоположность этому, в изучении миграции раной краем (см протокол 10.5-10.8), HUVECs являются культура в монослое до ранению. Как таковые, раной край HUVECs отображения относительно снимите ветвистый морфологию, простираться передней кромки выступающих частей, и имеют межклеточные взаимодействия со своими ближайшими соседями, поскольку они мигрируют в рану.
Предостережения и преимущества слежения MT Динамика в жизни HUVECs.
Вращающемся диске микроскопии является отличным подходом кпроверить экспериментальные гипотезы, которые требуют конфокальной четкость изображения с высоким временным разрешением. При соответствующей камеры и лазерный модуль, этот микроскопию подход чувствителен к низкой флуоресценции излучения и может помочь в сниженной фотообесцвечиванию по сравнению с другими типами флуоресцентной микроскопии. Важно отметить, что этот подход также хорошо подходит для средних и высоких времени разрешающей способностью, как это требуется для выработки комплексных измерений динамики роста МТ с использованием маркировки подход EB3, во множестве различных типов клеток.
В то время как методология EB3 маркировки выращивания МТ плюс-концы имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами флуоресцентной маркировки МЦ, он также имеет уникальные недостатки. Например, есть часть массива MT , который не активно растет в любой момент времени, в том числе как население дезассемблирование МЦ и населения Stábile, который нединамических МЦ 71-74. EB3 не маркировать эти две популяции МЦ иПоэтому вклад этих двух популяций не будут включены в экспериментальный анализ данных. Альтернативные методологии для оценки всего массива МТ сосредоточились на экспрессии флуоресцентно меченных тубулина, которая включает в себя во всех популяциях МЦ и позволяет идентифицировать растет, сокращается, и Stabile МЦ. Тем не менее, из-за относительно высокой плотности массива MT вблизи центра ячейки и рядом с микротрубочками организации центра (MTOC), маркировка весь массив МТ создает неудобство при выполнении анализа изображения концов МТ, которые не рядом с клеткой периферия 75-77. Эксперименты с использованием двухцветного совместного маркировки МЦ с флуоресцентным тубулина и флуоресцентного EB3 в живых клетках показали, качественно, что подавляющее большинство тубулина меченных МЦ также EB3 меченных 78. Кроме того, не было эффективным методом автоматизированного отслеживания МЦ, меченных флуоресцентной тубулина. Это означает, что данные COLLECния и измерения динамики МТ в клетках, экспрессирующих флуоресцентные тубулина требуют ручного отслеживания отдельных МЦ, процесс, который подвержен ошибкам и утомительным. В результате, автоматизированный вычислительный анализ EB3 меченый МЦ стала предпочтительным методологии для измерения динамики MT , как он может быть применен к МТ динамических экспериментов по многочисленным типам клеток и в различных экспериментальных режимах 35,79.
Связывание МТ Динамика роста к HUVEC морфологии и миграции.
С точки зрения исследователя цитоскелета, один чрезвычайно полезный адаптация plusTipTracker автоматизированного анализа отслеживания является возможность измерять и оценивать как целые клетки и региональные изменения в динамике роста МТ. Требование клетка, чтобы стать поляризованным является важнейшей предпосылкой для миграции направленной клеток. Как таковые, поляризованные сигналы сигнализации давно известны в качестве основных движущих факторов для направленной миграции клеток 30,31,51,54,56,80,81 </SUP>. Например, растворимые сигнальные молекулы , такие как VEGF вызывают полимеризацию актина и рост МТ к кия VEGF в эндотелиальных типах клеток 2,82-87. Кроме того, в ответ на физические взаимодействия с ECM (например, соблюдение и размерностью mechanosensing), HUVECs модулировать их динамику МТ путем локального регулирования MAPs для стимулирования роста МТ в пределах удлиняя ветвистые выпячивания, и это служит для направления миграции HUVEC в направлении из кий 5,31,88. Таким образом, поляризация в ответ на внеклеточные сигналы сигнализации указывает на необходимость экспериментальной оценки локализованных изменений в динамике цитоскелета.
Одновременная живых клеток визуализации динамики МТ роста (с использованием EB3 подход) и миграции HUVEC клеток чрезвычайно трудно выполнить, потому что МЦ растут на временной шкале секунд, в то время как изменения в морфологии клеток и направленной миграции происходят на временной шкале часов. Тем не менее, оба процесса тесно Линкеd. Кроме того, непрерывное, быстрое отображение флуоресцентно-меченых EB3 на втором временном масштабе приводит к фотообесцвечиванию сигнала EB3. Попытки преодолеть эту проблему путем проведения коротких серий изображений из EB3 (серии 1-2 приобретения мин) через каждые 30 минут были успешными, но может быть достигнуто лишь в небольшом количестве КЭ, которые имели оптимальное выражение EB3 и что не показали неблагоприятных эффекты многократного лазерного излучения 5.
Альтернативный подход , который позволяет интерпретации , как динамика роста МТ способствуют изменениям в морфологии клеток и миграции является plusTipTracker область интереса (ROI) инструмента 35 (см протокол 6.6). Эта методика позволяет весь рост клеток МТ отслеживает быть подразделена на определенных пользователем областей, из которых дорожки роста MT затем могут быть извлечены и проанализированы. Например, сравнение "разветвленной" против "неразветвленных" областей клетки показали, что МЦ растут больше Sсмирен и более настойчиво в разветвленных регионах по сравнению с не ветвящегося периферии клетки 5. В поляризованном раной края HUVECs, сравнения передней кромки и задней кромки динамики роста МТ показали, что MCAK индуцированный MT разборки тормозится конкретно внутри передней кромки, но не заднюю кромку. Региональная оценка ведущих и хвостовых динамику роста края МТ в HUVECs, выражающие Rac1 и / или фосфорилирования мутанты MCAK дополнительно показали, что Rac1-индуцированной активации Aurora-киназы специфически и локально ингибирует MCAK активность в переднем крае управлять HUVEC поляризацию и направленную миграцию 31. Таким образом, сочетание автоматического отслеживания динамики роста МТ и региональной оценки динамики роста МТ в рамках разветвленных выступам и / или переднем крае раны края HUVECs позволило нам связать динамику роста МТ к HUVEC морфологии и миграции.
Описанные протоколы Дизайнd, чтобы обеспечить в целом простой и высокой повторяемостью методологии HUVEC культуры и экспериментального исследования. Тем не менее, многие детали протокола сложны и требуют много времени, которое, в свою очередь, предоставляет возможность ошибки или трудности в проведении экспериментальной методологии. В то время была предпринята попытка решить потенциальные проблемы по всему протоколу, здесь предусмотрено дополнительное, детальное устранение неполадок потенциальных проблем, которые являются менее распространенными или иным образом сокращенно нот в протоколах методологии.
В связи с покровные покрытия с полиакриламидных субстратов (Протокол 2.2), общая проблема, которая возникает сложный характер активации покровные стекла, муфта полиакриламида к стеклу, активизируя полиакриламида, а затем муфта ЕСМ в полиакриламида. Одним из наиболее трудным и потенциально проблематичным стадию культивирования HUVECs на гель фибронектина / полиакриламидном после воздействия на Полнаcrylamide покрытием покровные до 2 мм сульфо-SANPAH (этап 2.2.2.6, выше). Это имеет решающее значение для успеха культивирования HUVECs на этих подложках, что сульфо-SANPAH быть полностью удалены из экспериментальной системы ECM следующего сопряжения. Это может быть лучше всего достигается путем промывки с DDH 2 O и инкубирования покровные в DDH 2 O на шейкере в течение ночи. Если клетки, культивируемые на полиакриламидном ЕСМ не выживают, или если жизнеспособность меньше, чем ожидалось, увеличение и повторное промывание сульфо-SANPAH после конъюгации с фибронектином (этап 2.2.2.9) рекомендуется потенциально облегчить эту проблему.
Относящиеся к Протоколу 3 (кДНК трансфекции и HUVEC культуры на покровное), большое влияние на успех процедуры электропорации является обращение с HUVECs как во время трипсином клеток, чтобы удалить их из пластиковой колбы, и после завершения электропорации (шаги 3,3-3,4, выше). Крайне важно, чтобы заботитьсяполностью контролировать HUVECs в то время как в трипсин, и не должно превышать времени, необходимого для клеток "облавы" на поверхности колбы (обычно 1-2 мин). Чрезмерное время в трипсин является одной из основных причин смерти HUVEC, которая, как правило, не реализуется до тех пор, пока клетки не высевают на фибронектина покрытием покровные (шаг 3.4), а затем не прикрепляться к субстрату.
Такую же важность, HUVECs (и большинство типов первичных клеток) не преуспевают, когда приостанавливается в течение длительного времени в буфере электропорации. В ходе крупномасштабных экспериментов, например, когда пользователь имеет пять или более условий, которые требуют электропорации, то лучше сохранить клетки осаждали в отдельные пробирки (1 туба на трансфекцию) и смешать их, то один-на-времени , в электропорации буфере непосредственно перед электропорацией. Такой подход сводит к минимуму время инкубации в буфере электропорации и развернутом выживания HUVEC. Кроме того, немедленного спасения в полной культуральной среде также крitical следующие электропорации. задержки спасании одну минуту или более следующих электропорации может привести к почти полной гибели HUVEC и, таким образом, следует избегать.
Относящиеся миграцию клеток для анализа (протокол 9), методика культивирования HUVECs при чрезвычайно высокой плотности зависит от критической модификации (описанного в пункте 9.2) традиционных HUVEC методики культивирования клеток (описанной в Протоколе 3), что требует высыхание фибронектина покрытием покровное для того, чтобы дать возможность HUVEC культуру в очень небольшой площади покровного. Часто, если покровное не полностью высушены или, если предварительное покрытие покровного с фибронектином (шаги 2,1 или 2,2), не была эффективной, средства массовой информации, содержащих клетки, записываемый на покровное потеряет ее поверхностное натяжение и расширить до Края покровного стекла, тем самым снижая плотность клеток на покровное. Один из способов устранения этой потенциальной проблемы является аспирация носитель из покровного, а затемместо покровное (все еще в 35-мм блюдо) в задней части шкафа биологической безопасности в течение 5-10 мин. Это приспособление может помочь, чтобы позволить потоку воздуха внутри шкафа, чтобы помочь в сушке блюдо. Если какой-либо видимой жидкость остается на покровное после сушки на воздухе, аспирация жидкие пятна и снова дайте высохнуть на воздухе в течение 5-10 мин дополнительного в шкафу биологической безопасности. Важно отметить, что не существует никакого способа, чтобы полностью избежать этой проблемы, но это действительно становится меньше проблемы при повторном практике протокола. Кроме того, рекомендация поиск и устранение неисправностей, что при подготовке покровные для миграции клеток анализа (или любого анализа, в целом), чтобы подготовить дополнительные покровные и имеют дополнительные HUVECs готовые к использованию в случае возникновения проблем по пути.
С учетом этих соображений по устранению неполадок в виду, это также важно, чтобы подчеркнуть полезность обсуждаемых протоколов и их последствий в будущих исследованиях клеточной биологии. Применимость к polyacrиламид подход в широком диапазоне, и включает в себя не только двумерные исследования взаимодействия клеток ECM (описанного выше), но и трехмерные исследования 5. Это приложение имеет решающее значение для повышения нашего понимания того, как HUVECs регулировать форму и миграцию клеток в физиологических условиях и должны обеспечить исследователям общее представление о том, как морфологические изменения согласовываются с цитоскелета изменениями. В то время как протоколы, описанные здесь сосредоточены на измерении динамики роста МТ, большинство протоколов может и должен быть адаптирован для измерения любого количества других микроскопически измеряемыми аспектов клеточного ECM взаимодействий. Что касается динамики MT, есть множество карт, в том числе по крайней мере , 14 семей кинезинов 89, каждая из которых имеет потенциальную роль в содействии HUVEC полярности и направленной миграции, и все из которых могут быть исследованы с использованием протоколов , представленных.
Будущие исследования должныРБП быть направлены на взаимодействие клеток ECM в нормальных по сравнению с больными состояний. HUVEC протоколы, представленные здесь, применимы к исследованию нормальных сосудистых гомеостатических процессов, а также болезненных состояний, в том числе сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатия, рост опухоли и метастазирование, чтобы назвать несколько. Связывая явно прозрачные ЕСМ и полиакриламида субстраты аменабельную соответствии с микроскопическими исследованиями позволит клеточной ECM обручальных исследований таким образом, что эндотелиальные клетки сосудистой ангиогенез можно наблюдать с высоким пространственным и временным разрешением. Эти типы экспериментальных подходов уже начали выявить важные различия в форме эндотелиальных клеток, полярности, миграции, а также эффекты белков , которые регулируют эти процессы 5,31,90. Дальнейшие усилия должны быть направлены на определение, как комбинация ECM соответствия и размерностью mechanosensing может служить для локального управления белков, которые нацелены и регулируют цитоскелета динамику.
The authors have nothing to disclose.
Особая благодарность доктору Clare M. Waterman для наставничества и дискуссий, Мишель Baird и Майк Дэвидсон для обеспечения многих флуоресцентных кДНК конструкций, используемых в этих исследованиях, и Кэтрин Эпплгейт и Gaudenz Danuser для разработки программного обеспечения для анализа plusTipTracker MT. Эта работа была поддержана, в частности, за счет гранта Кам из Национального сердца легких и крови институт (NHLBI) и Национальный институт здоровья (NIH). (Грант: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |