Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Angiogenes utlöses av extracellulära signalerings ledtrådar som främjar endotelceller (EC) för att polarisera, migrera med riktnings specificitet, och bilda nya kärl i vävnader som kräver blodtillförsel. Bidragande faktorer som tros driva angiogenes är signaler från den extracellulära matrisen (ECM). Som svar på fysiska signaler, EC förlänga nya kontor med riktnings specificitet för att styra riktad rörelse i bildandet av den vaskulära nätverket 1,2. Arkitekturen i EG-morfologi och förgrening definieras av lokal reglering av mikrotubuli (MT) cytoskelettet på ett sätt som är samordnad med regleringen av acto-myosin kontraktilitet 3. För EG grenar för att bilda måste myosin-II lokalt nedregleras, vilket resulterar i lokala membran utsprång 4. Samtidigt och på samma plats i cellen, blir MT tillväxtdynamik modifierade resulterar i långsam och ihållande MT tillväxt för att främja gren Elondighet och stabilitet 5. Detta samordnade cytoskelettala reglering tillåter EC att polarisera deras morfologi för att underlätta riktad migration.
Utvecklingen av en polariserad cellmorfologi kräver polariserat MT enheten 6. Migrera epitelceller, MT växer långsamt och ihärdigt särskilt vid den främre kanten av cellen 7-9; medan i neuroner, initiering och förlängning av axoner eller dendriter kräver att MT är inte bara närvarande, men att de är dynamiskt genomgå processerna för montering och demontering 10-15. På detta sätt, lokal kontroll över MT tillväxtdynamik bestämmer arkitekturen i cellen och möjliggör snabb ombyggnad av cellmorfologi som EC navigera genom sin ECM.
MT tillväxtdynamiken regleras av familjer av molekylära motorproteiner och icke-motorproteiner, benämnda mikrotubuli associerade proteiner eller mikrotubuli växelverkande proteiner (hädanefter Referred till kartor). Kartor kan lokalt aktiveras eller inaktiveras, vanligtvis via signaleringskaskader initierade vid cell ECM-gränssnittet 16,17 den. När aktiv, kartor funktion genom att binda till MT och förändra kinetiken för MT montering och demontering; därigenom fungerar lokalt reglera MT dynamik i syfte att främja cellform och polaritet 18-20. Mitotiska centromer Associated Kinesin (MCAK) är en Kinesin-13 familjen MAP som binds till MT ändar och par ATP hydrolys till MT demontering 21-23. Denna funktionella roll MCAK är känd för att vara kritisk i den mitotiska spindeln 24-28, samt under interfas 29,30. Inom inter EC är MCAK medierad MT demontering regleras genom lokaliserad Aurora-A-inducerad fosforylering av MCAK som svar på sår kant inducerad aktivering av RAC1 små GTPas. Resultatet av denna signalkaskad är hämningen av MCAK i framkant av EC, vilket resulterar i polariserat MT tillväxt mot leading kant och MCAK-inducerad MT demontering vid bakkanten att migrera EC 31.
Traditionella metoder för att mäta MT tillväxtdynamiken har vanligtvis används handen spårning av antingen fluorescensmärkt tubulin eller, mer nyligen, fluorescensmärkt MT end bindande protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3 respektive). Den fluorescerande tubulin tillvägagångssätt har fördelen att märkning av hela MT array. Emellertid, därför att majoriteten av mitotiska celltyper bibehålla en radiell array med MTs under interfas 8,32,33, MTs nära centrosom är mycket tät, och som ett resultat, spårning MT tillväxt och demontering med fluorescerande tubulin är vanligen begränsad till den perifera regioner av cellen. På grund av dessa begränsningar, har användningen av fluorescensmärkta EB proteiner (EB1 eller EB3) varit vanligare metod för att mäta MT dynamik. Eftersom EBS endast märka de växande plus-ändarna av MTS, de verkar så liten (1-3 pm), ljust fluorescerande kommats, vilket ger en lätt urskiljbara markör för MT polymerisation med mycket begränsad bakgrundsfluorescens 34-37. Även det faktum att EBS etiketten endast en delmängd av MT arrayen representerar en stor styrka av EB tillvägagångssätt belyser också en viktig begränsning är att icke växande MT inte märkt av EB3 strategi. Ändå förmågan att mäta och följa EB3 kometer över tiden och att visualisera MT tillväxt inom undercellulära regioner gör denna metod idealisk för applikationer som kräver regionala utvärdering av MT organisation.
En annan kritisk begränsning av traditionella metoder för att mäta MT tillväxtdynamiken har varit mycket stora datamängder och den tid som krävs för dataanalys. Denna begränsning härrör från behovet av handen spårning av hundratals EB kometer med hög tidsupplösning. Dessutom är dessa mätningar måste göras på ett statistiskt signifikant antal celler och även utföras under en mängd olika kontroll och experimespecialist- villkor. Nyligen har dessa begränsningar övervunnits genom beräkningsanalystekniker specifikt riktade mot spårning EB3 kometer med time-lapse mikroskopi i levande celler 35. När det används på rätt sätt, tjänar detta beräknings förhållningssätt till både begränsar risken för mänskliga fel i samband med hand spårning förutom att ge en hög genomströmning metod för att mäta MT polymerisation. Beräknings analys av MT dynamik med hjälp av MatLab-baserad mjukvara, plusTipTracker, möjliggör mätningar av MT tillväxt genom att spåra fluorescensmärkta EB3 kometer 5,31,35,38. Dessutom ger plusTipTracker programvara för beräkningar av MT katastrofhändelser (aka demontering) baserat på försvinnandet av EB3 kometer inom en växande MT spår, och gör det möjligt att sub-cellulära (aka regionala) analys av MT tillväxtdynamiken inom användardefinierade områden av intresse . För våra studier var MT tillväxtdynamiken jämföras inomgrenade regioner jämfört med icke-grenade regioner eller inom ledande kontra bakre cellkanter. utdata från plusTipTracker programvara kan också användas för att generera färgkodade spår över för enskilda celler och sub-cellulära regioner.
Här beskriver vi den metod som används för att undersöka vilken roll MCAK modulera MT tillväxtdynamik och bidrag denna MT depolymerase till regleringen av EG förgrenings morfologi och riktad migration. Vår metod som används en primär human cellinje, Human navelvenendotelceller (HUVEC), som är lätt odlas och mycket mottagliga för elektroporering-inducerad, övergående transfektion av plasmid cDNA. Vi använde sedan med hög upplösning, time-lapse fluorescensmikroskopi av HUVEC transfekterade med MT end bindande protein 3 (EB3) och Mitotisk centromer Associated Kinesin (MCAK) -specifika cDNA konstruktioner för att utvärdera effekterna på MT dynamik transfekterade HUVEC. PlusTipTracker baserade beräknings bildanalys av EB3-märkt MT plus ändar var att mäta MT tillväxthastigheter och MT tillväxt livslängd i tidsförlopp bilder, för att mäta och jämföra effekterna av experimentella manipulationer på MT tillväxtdynamiken. Denna metod gör det möjligt att studera MT dynamik och identifiering av hur lokal reglering av MT dynamik inom sub-cellulära regioner bidrar till angiogena processer EG förgrening och migration. Dessa tekniker kan tillämpas på undersökningar av någon karta som kan fluorescerande och uttrycks i levande celler.
Använda HUVEC i morfologi och migrations Experiment.
Live-cell imaging av EB3-märkt MT tillväxtdynamiken inom HUVEC kräver lämpliga och reproducerbara cellodlingsbetingelser för att mäta och utvärdera förändringar i MT tillväxt och HUVEC morfologi, så att de sedan kan hänföras till en ECM-signal cue. HUVEC utgör en utmärkt modell för att studera cellform och motilitet. De är mycket mottagliga för transfektion med fluorescensmärkta cDNA uppvisar de dramatiska morfologier som svar på både lösliga och fysiska signalerings signaler, och de bibehåller förmågan att organisera sig i vaskulära rör när de tillhandahålls lämpliga cellodlingsbetingelser 65-70. Primära cellodlingar, såsom HUVEC, kräver noggrann hantering och övervakning av cellpassager nummer för att säkerställa att cellerna är friska och att de kommer att bete sig normalt under experiment. Till exempel, när de utför experiment som undersöker cytoskeleton och / eller cell morfologi, bör HUVEC inte användas för experiment utanför tionde cellodlings passage, som HUVEC börjar vanligtvis att visa oenhetliga morfologier runt passagen tolv till femton.
Celldensiteten är också en kritisk regulator av HUVEC hälsa och proliferation. HUVEC förgreningsUndersökningar (se protokoll 10,1-10,4, ovan) använda relativt låga kulturer celltäthet för att ge cellerna fysiskt utrymme för att interagera med sin ECM och att utvidga grenade utsprång. Däremot i sår-kantstudier migrations (se protokoll från 10,5 till 10,8), HUVEC är kultur i ett monoskikt innan sårskada. Som sådan, sår-kant HUVEC visar en relativt un-grenade morfologi, förlänga ledande kant utsprång och uppvisar cell-cell-interaktioner med sina närmaste grannar när de flyttar in i såret.
Varningar och Fördelar med spårnings MT Dynamics i Living HUVEC.
Spinning disk mikroskopi är en utmärkt metod för atttesta experimentella hypoteser som kräver konfokala bildkvalitet med hög tidsupplösning. Med lämplig kamera och lasermodul, är detta mikroskopi tillvägagångssätt känslig för låga fluorescensemission och kan hjälpa till vid reducerad fotoblekning i förhållande till andra typer av fluorescensmikroskopi. Viktigt är denna metod också väl lämpad för måttlig till hög tidsupplösning som krävs för att generera omfattande mätningar av MT tillväxtdynamik med hjälp av EB3 märkningstillvägagångssättet, i en mängd olika celltyper.
Medan EB3 metoder för märkning växande MT plus-ändar har tydliga fördelar jämfört med andra metoder för fluorescerande märkning MT har också unika nackdelar. Till exempel finns det en del av MT array som inte är aktivt växande vid en viss tidpunkt, både befolkningen i demontering MTS och befolkningen i stabila, icke-dynamiska MT 71-74. EB3 skulle inte märka dessa två populationer av MTS ochdärför inte skulle ingå bidrag dessa två populationer i experimentell dataanalys. Alternativa metoder för att utvärdera hela MT array har fokuserat på uttryck av fluorescensmärkt tubulin, som införlivar alla populationer av MTS och gör det möjligt att identifiera växande, krympande och stabil meter. Men på grund av den relativt höga densiteten hos MT array nära mitten av cellen och intill den mikrotubuli organisera centrum (MTOC), märkning av hela MT array skapar en nackdel i att utföra bildanalys av MT ändar som inte är i närheten cellen periferi 75-77. Experiment med hjälp av två-färg co-märkning av MT med fluorescerande tubulin och fluorescerande EB3 i levande celler har visat kvalitativt, att de allra flesta av tubulin-märkta MT är också EB3-märkt 78. Dessutom har det inte funnits en effektiv metod för automatiserad spårning av MT märkta med fluorescerande tubulin. Detta innebär att data kollekning och mätningar av MT dynamik i celler som uttrycker fluorescerande tubulin kräver handen spårning av enskilda MTS, en process som är felbenägen och tråkiga. Som ett resultat har automatiserad computational analys av EB3 märkta MTs blivit den föredragna metod för mätning av MT dynamik eftersom den kan tillämpas på MT dynamik experiment över flera celltyper och inom en mängd olika experimentella regimer 35,79.
Länka MT Growth Dynamics till HUVEC morfologi och migration.
Ur en cytoskelettala utredare, är en extremt användbar anpassning av plusTipTracker automatiserad spårning analys förmågan att mäta och utvärdera både hela celler och regionala förändringar i MT tillväxtdynamiken. Kravet på en cell för att bli polariserad är en viktig förutsättning för riktad cellmigrering. Som sådan, polariserade signalerings ledtrådar har länge varit kända som viktiga drivkrafter för riktad cellmigrering 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. Till exempel, lösliga signalmolekyler såsom VEGF inducerar aktin polymerisation och MT tillväxt mot VEGF kö i endothelial celltyper 2,82-87. Dessutom, som svar på fysiska samverkan med ECM (t.ex. efterlevnad och dimension mechanosensing), HUVEC modulera sina MT dynamik genom att lokalt reglera Kartor för att främja MT tillväxt inom förlängning grenade utsprång, och detta tjänar till att vägleda HUVEC migration i riktning mot cue 5,31,88. Således, polarisering som svar på extracellulära signalerings ledtrådar understryker behovet av experimentell utvärdering av lokala förändringar i cytoskelettala dynamik.
Samtidig levande cell imaging av MT tillväxtdynamik (med hjälp av EB3 tillvägagångssätt) och HUVEC cellmigration är extremt svårt att utföra eftersom MT växa på en tidsskala sekunder, medan förändringar i cellmorfologi och riktad migration förekommer på en tidsskala av timmar. Ändå båda processerna är intimt Linked. Dessutom kontinuerlig, snabb avbildning av fluorescensmärkt EB3 på andra tidsskalan leder till fotoblekning av EB3 signalen. Försök att lösa detta problem genom att göra korta avbildning serie EB3 (1-2 min förvärv serien) var 30 minuter har varit framgångsrika, men kunde bara åstadkommas på ett litet antal EC som hade optimal expression av EB3 och som inte uppvisar negativa effekter av upprepad laserbelysning 5.
Ett alternativt tillvägagångssätt som gör det möjligt för tolkningar av hur MT tillväxtdynamiken bidrar till förändringar i cellmorfologi och migration är plusTipTracker Region of Interest (ROI) verktyg 35 (se protokoll 6,6). Denna metod gör det möjligt för hela cell MT tillväxt spår att delas upp i användardefinierade områden, där MT tillväxtspår då kan extraheras och analyseras. Till exempel, har jämförelser av "grenad" kontra "icke-grenade" regioner av cellen avslöjade att MTs växa fler södmjuk och mer ihärdigt inom grenade regioner jämfört med den icke-grenade cell periferi 5. I polariserad sår kant HUVEC, jämförelser av framkanten och bakkanten MT tillväxtdynamiken avslöjade att MCAK-inducerad MT demontering hämmas specifikt inom framkanten, men inte bakkanten. Regional utvärdering av främre och bakre kant MT tillväxtdynamiken i HUVEC uttrycker RAC1 och / eller fosforylering mutanter av MCAK avslöjade vidare att RAC1-inducerad aktivering av Aurora-A-kinas specifikt och lokalt hämmar MCAK aktivitet inom framkanten för att driva HUVEC polarisering och riktad migration 31. Således har kombinationen av automatiserad spårning av MT tillväxtdynamik och regional utvärdering av MT tillväxtdynamiken inom grenade utsprång och / eller framkanten av sår kant HUVEC tillät oss att koppla MT tillväxtdynamiken till HUVEC morfologi och migration.
Protokollen är designed för att ge en i huvudsak enkel och hög repeterbarhet metod för HUVEC kultur och experimentella undersökningar. Ändå är många av de protokollinformation är komplexa och tidskrävande, vilket i sin tur ger möjlighet för fel eller svårigheter med att leda den experimentella metodik. Även om det försökte att ta itu med potentiella problem i hela protokollet här ges ytterligare, detaljerad felsökning av potentiella problem som är mindre vanliga eller på annat sätt förkortat noter inom metodprotokoll.
Relaterade till beläggningstäck med poly-substrat (protokoll 2,2), ett vanligt problem som uppstår är den komplexa naturen att aktivera glastäck, koppling polyakrylamid till glaset, aktiverande polyakrylamid, och sedan koppla ECM till polyakrylamid. En särskilt svår och potentiellt problematiskt steg odling HUVEC på fibronektin / polyakrylamidgel efter exponering av polyAcrylamide belagda täckglas till 2 mM sulfo-SANPAH (steg 2.2.2.6, ovan). Det är avgörande för framgången för odling av HUVEC på dessa substrat som sulfo-SANPAH tas bort helt från det experimentella systemet efter ECM konjugering. Detta kan bäst åstadkommas genom tvättning med ddHaO 2 O och inkubera täckglas i DDH 2 O på en skakare över natten. Om celler odlade på polyakrylamid-ECM: n inte överlever, eller om livsduglighet är mindre än väntat, ökad och upprepad tvättning av sulfo-SANPAH efter konjugering till fibronektin (steg 2.2.2.9) rekommenderas för att potentiellt minska detta problem.
Relaterade till protokoll 3 (cDNA transfektion och HUVEC kultur på ett täck), en stor inverkan på framgången för elektroporering förfarande är hanteringen av HUVECs både under trypsinisering av cellerna för att ta bort dem från plastflaska, och efter ingåendet av elektroporering (steg från 3,3 till 3,4, ovan). Det är viktigt att ta handfullständigt övervaka HUVEC medan i trypsin, och att inte överskrida den tid som behövs för cellerna till "round-up" på ytan av kolven (typiskt 1-2 min). Alltför mycket tid i trypsin är en viktig orsak till HUVEC död, som är normalt inte realiseras tills cellerna stryks ut på fibronektinbelagda täckglas (steg 3,4) och sedan misslyckas med att fästa till substratet.
Av lika stor betydelse, inte HUVEC (och mest primära celltyper) inte klarar sig bra när de är suspenderade under långa tider i elektroporering buffert. Under större skaleexperiment, till exempel, där användaren har fem eller flera villkor som kräver elektroporering, är det bättre att hålla cellerna pelleterade i individuella rör (1 rör per transfektion) och att blanda dem, en-at-a-time i elektroporering buffert omedelbart före elektroporering. Detta tillvägagångssätt minimerar inkubationstid i elektroporering buffert och maximerad HUVEC överlevnad. Dessutom är omedelbar räddning i fullständigt odlingsmedia också spitical följande elektroporation. Räddnings förseningar på en minut eller mer efter elektroporering kan resultera i nästan fullständig HUVEC död och därför bör undvikas.
Relaterade cellmigrationsassay (Protokoll 9), den teknik för odling av HUVEC vid extremt hög täthet är beroende av en kritisk modifiering (beskrivs i steg 9,2) av den traditionella HUVEC cellodlingsmetod (beskriven i protokoll 3) som kräver torkning av fibronektin belagda täckglas för att göra det möjligt för HUVEC kultur i en mycket liten del av täck. Ofta, om täckglaset inte är helt torr eller om den tidigare beläggningen av täckglas med fibronektin (steg 2,1 eller 2,2) var inte effektiva, de medieinnehållande celler som är placerade på täckglas kommer att förlora sin ytspänning och expandera till kanterna på täckglas, vilket minskar tätheten av celler på täckglas. En metod för att felsöka detta potentiella problem är att aspirera media från täck och sedanPlacera täck (fortfarande i sin 35mm skål) på baksidan av biosäkerhet skåpet för 5-10 min. Denna anpassning kan bidra till att tillåta flödet av luft inom skåpet för att hjälpa till att torka skålen. Om någon synlig vätska kvar på täck efter lufttorkning, aspirera flytande fläckar och återigen låt lufttorka i 5-10 ytterligare minuter i biosäkerhet skåpet. Det är viktigt att notera att det inte finns något sätt att helt undvika detta potentiella problem, men det blir mindre av ett problem med upprepade praktiken av protokollet. Det är också en felsökning rekommendation att vid utarbetandet av täck för analysen cellmigration (eller någon analys i allmänhet), för att förbereda extra täck och har extra HUVEC ready-to-go i händelse av problem på vägen.
Med dessa felsöknings överväganden, är det också viktigt att framhålla nyttan av de protokoll som diskuterats och deras konsekvenser i framtiden cellbiologisk forskning. Tillämpningen på polyacrylamid tillvägagångssätt är omfattande och inkluderar inte bara tvådimensionella studier av cell-ECM engagemang (beskriven ovan), utan också tredimensionella undersökningar 5. Denna ansökan är avgörande för att öka vår förståelse av hur HUVEC reglerar cellform och migration i fysiologiska miljöer och bör ge utredarna en grundläggande förståelse för hur morfologiska förändringar samordnas med cytoskelettala förändringar. Medan protokoll som beskrivs här är inriktade på mätningar av MT tillväxtdynamiken, de flesta av protokollen kan och bör anpassas för att mäta ett antal andra mikroskopiskt mätbara aspekter av cell ECM interaktioner. När det gäller MT dynamik, det finns många kartor, varav minst 14 familjer kinesiner 89, var och en med en potentiell roll för att bidra till HUVEC polaritet och riktad migration, och alla som kan undersökas med hjälp av de protokoll som presenteras.
Framtida undersökningar bör enLSO riktas till cell ECM engagemang i normal kontra sjukdomstillstånd. HUVEC protokoll som presenteras här gäller för undersökningar av normala vaskulära homeostatiska processer, samt sjukdomstillstånd, inklusive hjärtsjukdomar, retinopati, tumörtillväxt och metastas, för att nämna några. Konjugera synligt transparent ECM och polyakrylamid substrat av mottaglig överensstämmelse med mikroskopiska undersökningar kommer att möjliggöra cell-ECM engagemang studier så att endotelceller vaskulär angiogenes kan övervakas med hög spatial och temporal upplösning. Dessa typer av experimentella metoder har redan börjat att avslöja viktiga skillnader i endotelceller form, polaritet, migration, och effekterna av proteiner som reglerar dessa processer 5,31,90. Framtida insatser bör syfta till att fastställa hur kombinationen av ECM efterlevnad och dimension mechanosensing kan användas för att lokalt kontrollproteiner som riktar och reglerar cytoskelettala dynamik.
The authors have nothing to disclose.
Ett särskilt tack till Dr. Clare M. Waterman för mentorskap och diskussioner, Michelle Baird och Mike Davidson för att tillhandahålla många av de fluorescerande cDNA-konstruktioner som används i dessa studier, och Kathryn Applegate och Gaudenz Danuser för att utveckla plusTipTracker MT analysprogram. Detta arbete stöddes delvis av ett bidrag till KAM från National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) och National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |