An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
Den kanoniska uppsättning av aminosyror leder till en ovanligt brett spektrum av proteiner fungerar. Ändå ställer uppsättningen av rester fortfarande begränsningar på potentiella proteinapplikationer. Införlivandet av noncanonical aminosyror kan förstora denna omfattning. Det finns två kompletterande metoder för införlivande av noncanonical aminosyror. För platsspecifik inkorporering, utöver de endogena kanoniska translationella maskiner, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetas-tRNA par måste tillhandahållas som inte interagerar med de kanoniska dem. Följaktligen ett kodon som inte har tilldelats till en kanonisk aminosyra, vanligtvis en stoppkodon, även är nödvändig. Denna genetiska koden expansionen möjliggör införlivandet av en noncanonical aminosyra vid en enda, givet ställe inuti proteinet. Den här presenterade arbetet beskriver rester specifika inkorporering där den genetiska koden omtilldelas inom den endogena translationella systemet. Översättningen maskiner enccepts den noncanonical aminosyran som ett surrogat för att införliva det vid canonically föreskrivna platser, det vill säga är alla förekomster av en kanonisk aminosyra i proteinet ersättas med noncanonical en. Införlivandet av noncanonical aminosyror kan ändra proteinstrukturen, vilket orsakar avsevärt modifierade fysikaliska och kemiska egenskaper. Noncanonical aminosyraanaloger fungerar ofta som celltillväxthämmare för uttrycksvärdar eftersom de ändrar endogena proteiner, vilket begränsar in vivo proteinproduktion. In vivo inkorporering av giftiga noncanonical aminosyror i proteiner förblir särskilt utmanande. Här, är ett cellfritt tillvägagångssätt för en fullständig ersättning av L-arginin genom noncanonical aminosyran L-kanavanin presenteras. Det kringgår de inneboende svårigheterna för in vivo expression. Dessutom är ett protokoll för att framställa målprotein för masspektralanalys ingår. Det visas att L-lysin kan ersättas med L-hydroxi-lysin,om än med lägre effektivitet. I princip kan vilken som helst noncanonical aminosyraanalog införlivas med användning av den presenterade metoden så länge som den endogena in vitro translationssystem känner igen den.
Den genetiska koden är universell till biosfären. Den kodar för en uppsättning av 20 kanoniska aminosyror, som ibland förlängs med selenocystein pt eller pyrrolysine 2. Det är ribosomen som översätter den genetiska koden med hjälp av tRNA-sekvenser till kedjor av aminosyror som fälls in i proteiner. De funktionella grupperna i de kanoniska aminosyror, i kombination med posttranslationella modifieringar, bidra till en exceptionellt brett spektrum av proteinfunktion 3,4. I princip kan funktionsbegränsningar på grund av begränsad uppsättning kanoniska aminosyror övervinnas genom att införliva ytterligare noncanonical aminosyror (NCAAsen) som gör det möjligt för nya verksamma ämnen och nya funktioner 3,4.
Det finns två kompletterande metoder för införlivande av NCAAsen: den plats eller resten specifika inkorporering. Den tidigare metoden innebär betydande tekniska svårigheter, eftersom den kanoniska uppsättning av aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) och tRNA måste utökas med en ortogonal Aars-tRNA par som inte måste samverka med den endogena översättnings maskiner. Baserat på noggrann teknik, innehåller denna metod de NCAAsen som enskilda punktmutationer vid de önskade proteinställen. Platsspecifik inkorporering av NCAAsen är genetiskt kodas av ett kodon som inte har tilldelats till en kanonisk aminosyra (CAA), vanligtvis ett stoppkodon 5-9. Denna metod medför förändringar i funktion vid en given plats i stället för över hela proteinet 10-13.
Däremot förlitar rester specifika inkorporering på felaktig erkännande av noncanonical aminosyran av den kanoniska översättningen maskiner. Införlivandet sker på grund av bristen på substratspecificiteten av de AARS. Återstoden specifika inkorporering av NCAAsen, byggd på arbetet i Cohen och medarbetare 14, har lett till viktiga tillämpningar 3,10, bland dem bio-ortogonala märkning 15-17 av proteinereller struktur klarläggande av proteiner i röntgenkristallografi 18.
Som naturliga AARS allmänhet föredrar deras besläktade aminosyra över en isostrukturell NCAA, effektivt in vivo restspecifika införlivande kräver vanligen en auxotrof uttryck värd inte kan syntetisera den kanoniska analoga av NCAA. Värdcellerna odlas i tillväxtmedium som levererar endast en låg koncentration av den analoga CAA. Dess utmattning i kombination med den konsekutiva tillskott med NCAA tvingar expressionsvärden att införliva NCAA in i modellprotein vid multipla, kanoniskt föreskrivna platser. I motsats till den platsspecifika synsätt, har detta i allmänhet en djup inverkan på hela proteinstrukturen, vilket leder till betydligt modifierade fysikaliska och kemiska egenskaper hos proteiner 19,20. Men de flesta av NCAAsen är tillväxthämmare för expressionsvärden 3, eftersom de är införlivade i många andra protEins förutom de som är intressanta under rekombinant genuttryck. Detta begränsar klart in vivo tillvägagångssätt. In vivo-inkorporering av aminosyror som är giftiga eller har starkt inflytande på proteinstrukturen förblir särskilt utmanande. Men dessa molekyler är bland de mest lovande att konstruera proteiner med extra funktioner.
Ett exempel är giftiga, noncanonical, naturligt förekommande L-kanavanin (Can), en analog av L-arginin (Arg). Det påverkar och blockerar arg associerade regulatoriska och katalytiska reaktionsvägar, och dess närvaro i den levande cellen kan leda till omedelbar död 3,21-23. Dess införlivande i proteiner vid arginin positioner kan minska proteinstabilitet 21-23. På grund av den resulterande toxicitet, förblir uttrycket av kanavanin innehållande proteiner i Escherichia coli (E. coli) och andra vanliga expressionsvärdar en utmaning. Av dessa skäl, komplett in vivo incorporation Can på alla Arg positioner har lämpligt bekräftats endast en gång 24, med hjälp av en utarbetade enda proteinproduktionssystem. Emellertid har Can föreslagits som ett anti-cancermedel 25-27, och som en stimulator för autoimmuna sjukdomar hos människor 28. Dessutom är det föremål för olika studier på sin anti-metaboliska, antibakteriell, svampdödande och antivirala egenskaper 25. Dessa egenskaper upp en efterfrågan på effektiva och lätt utföra metoder för att uttrycka Kan proteiner för medicinska för apotek och funktionella studier.
Även om många problem som är anslutna till in vivo-produktion kan kringgås genom att använda cellfria expressionssystem, in vitro restspecifika tillvägagångssätt har endast varit dåligt utforskade. Det cellfria rest-specifik inkorporering av en L-tryptofan-analog 29 och multipel NCAAsen 30 har rapporterats. Dessa metoder är baserade på den mycket efficient T7 RNA-polymeras. T7 RNA-polymeras innebär bakteriofag liknande transkription, varigenom genetisk funktionalitet i jämförelse med endogena transkription.
Den kompletta återstoden specifika inkorporering av Can i ett modellprotein på alla Arg positioner rapporterades nyligen 31, med hjälp av ett cellfritt uttryckssystem 32. En liten ändring av samma system aktiverat platsspecifik inkorporering av olika pyrrolysine analoger i ett modellprotein via stoppkodon undertryckande 33. Sysselsatta cellfritt system 31-33 grundar sig på en allt E. coli transkriptionstranslationssystem. Icke desto mindre möjliggör den proteinuttryck så effektivt som i löpande bakteriofag system (0,5-1 mg / ml av rekombinant protein) 32, under bibehållande av mycket av den ursprungliga transkriptions-translations-modularitet.
I detta arbete är ett detaljerat protokoll lämnas om hur residue specifik inkorporering av NCAAsen kan realiseras med användning av detta hela E. coli cellfritt system 32. Dessutom är ytterligare åtgärder för att förbereda de uttryckta proteinerna för lämplig utvärdering via HPLC-ESI masspektroskopi föreslås. Att utöka egenskaperna hos denna cellfritt system, innebär detta arbete inte bara hänvisa till den publicerade införlivandet av Can 31 men också presenterar nya uppgifter om noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.
Följande protokoll för återstoden specifika införlivande av NCAAsen är en anpassning av ett protokoll som nyligen publicerades i JUPITER 34. Den senare protokollet beskriver hur du utför effektiv cellfria uttryck med vanliga aminosyror. Vidare presenterar den vid framställningen av det råa cellfritt extrakt, aminosyralösningen, den energi stamlösningen och den energi buffert som används i detta tillvägagångssätt. Följande protokoll fokuserar på modifierade steg i jämförelse med föregående protocol så att återstoden specifika inkorporering av NCAAsen. Kalibrerade pipetter, låg bindande pipettspetsar och mikro centrifugrör rekommenderas för beredningen. I det följande, är lUPAC förkortningar för aminosyrorna används.
An-lätt att använda cellfria expressionssystem som en hållbar strategi för att rester specifikt införliva NCAAsen till proteiner, presenteras. För detta ändamål är det råa extraktet kompletterat med vektor-DNA som kodar för proteinet av intresse, energibuffert och motsvarande aminosyror. Observera att råextraktet alikvotens volym beror på råextraktet proteinkoncentrationen 34. Det cellfria expressionseffektiviteten är optimerad beroende på vektor-DNA-konstruktion koncentration. Volymerna av de energibuffertkomponenter variera som funktion av optimerad Mg- och K-glutamat koncentrationer för att möjliggöra höga utbyten av den cellfria uttryckt modellprotein.
En preliminär utvärdering av inkorporeringen experiment kan erhållas genom att utföra SDS-PAGE av den orenade cellfria reaktionsmediet. För en mer detaljerad analys, är HPLC-ESI masspektroskopi föreslagits som ett sätt att kontrollera för fullständig, rester specifika INCORporering av NCAA. Som en förberedelse för det senare, är spinnkolonn system som används för att göra det möjligt för His-tag rening och buffertutbyte med små volymer som vi använder i detta protokoll.
Inklusive HPLC-ESI masspektroskopi, kan hela protokollet genomföras inom 2 dagar. Det innehåller inte några särskilt viktiga steg. Men koncentrations optimeringar av Mg- och K-glutamat samt av vektor-DNA är avgörande för att uttrycka höga utbyten av modellprotein. Användningen av den högeffektiva expressionsvek pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 rekommenderas starkt. Eluering av His-märkta proteiner är oftast på grund av hög koncentration av imidazol (> 150 mm) och andra salter såsom NaH 2 PO 4 (> 300 mm) eller NaCl (> 50 mM) som genererar höga bakgrundsljud i massanalys spektroskopiska 49 . Utbyte av sådana elueringsbuffertar med en lämplig proteinminnesbuffert stabiliserar modell protei och drastiskt minskar bakgrundsljud under massanalys spektroskopiska.
Som ett resultat kan ersätter Arg i alla sex positioner inom modellprotein. I expressionssystemet kan inga Arg-rester detekteras. Detta förenklar återstoden specifika inkorporering av Arg analoger jämfört med andra expressionssystem som kräver ytterligare utarmning strategier 29,30. De presenterade cellfria tillvägagångssätt kringgår de inneboende begränsningar i vivo tillvägagångssätt som beror på Can toxicitet, eller den starka beroendet av mRNA-sekvensen i en enda proteinproduktionsstrategier 24,31. I motsats till de anställda de vitro-system, in vivo klyvning av Can homoserinlakton och hydroxyguanidine inträffar 31.
Emellertid bibehåller det cellfria systemet en tillräcklig mängd av Lys att konkurrera med analoger såsom Hyl. HPLC-ESI mass-spektroskopisk analys visar att modellen proteinet innehåller både, den canonical liksom den noncanonical analog i olika proportioner. Återstoden specifika införlivande av Lys är möjligt i allmänhet, men för fullständig substitution, ytterligare utarmning strategier, eller specialkonstruerade Aars och tRNA optimerad för erkännande av NCAAsen måste utvecklas.
Vi uppnådde utmärkta utbyten av cellfria uttryckta, modifierade modellproteiner genom tillsats NCAAEN vid samma koncentration som de kanoniska sådana. Införlivandet effektivitet beror på naturen av NCAA som skall införlivas. Även högre utbyten kan fortfarande vara realiserbara genom optimering av koncentrationen av NCAA.
De presenterade resultaten visar tillämpligheten av sysselsatta system för återstoden specifika införlivande av NCAAsen så länge de accepteras av den kanoniska endogena translationella systemet. För återstoden specifika inkorporering av specifika NCAAsen, till en ytterligare behov kontrollera om de rester av den analoga CAA disturb expressionssystemet.
Cellfria system transkriptionstranslations kan konstrueras från olika organismer att svara på olika krav 54. Todos E. coli transkription-translations maskinerier av den här presenterade cellfritt system möjliggöra användningen av bakteriofag och E. coli promotorer, och de kan agera parallellt eller efter varandra i kaskader 55. Den allmänna tillämplighet och användbarhet gör metoden ett kraftfullt verktyg för vidare forskning inom aminosyra toxicitet och terapeutisk användning.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |