Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
למקסם את התועלת של תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) למחקר, דוגמנות מחלה, תרופות ויישומים קליניים דורש שיטות חזקות עבור הייצור בקנה המידה הגדולה של סוגי תא פונקציונליים, כוללים שריר לב. כאן אנו מראים כי המניפולציה הזמנית של Wnt, TGF-β, ו ששישה מסלולי איתות מובילה בידול cardiomyocyte היעיל ביותר של קווי תא בודד passaged hPSC בשנייה השעיה סטטי ומערכות bioreactor ההשעיה עוררה. העסקת אסטרטגיה זו הביאה ~ 100 spheroids להכות%, בעקביות המכיל> 80% טרופונין לבבי תאי T-חיובי לאחר 15 ימים של תרבות, תוקף בקווים hPSC מרובים. כמו כן, אנו מדווחים על וריאציה של פרוטוקול זה לשימוש עם שורות תאים אינם מותאמים כיום passaging תא בודד, להצלחת אשר אומת ב- 42 קווי hPSC. Cardiomyocytes שנוצר תוך שימוש בפרוטוקולים אלה מבטאים סמני שושלת ספציפית electrophys צפוי להראותפונקציות iological. הפרוטוקול שלנו מציג פלטפורמה פשוטה, יעילה חזקה עבור הייצור בקנה המידה הגדולה של cardiomyocytes אדם.
תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs), כולל בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע מושרים (hiPSCs), יש את היכולת של התחדשות עצמית ואת היכולת להתמיין לתאי של שלוש שכבות נבט עובריים 1,2. בשל תכונותיו אלה, hPSCs לספק מקור חשוב ובלתי מוגבל לייצור ההדור וניתן להרחבה של סוגי תא רלוונטי מחל למידול מחל אנושי 3-5, עבור מבחני הקרנת סמי תפוקה גבוהה ורעילים 6,7 ואפשרות ליישומים קליניים 8 . דור של cardiomyocytes מ hPSCs מספק את ההזדמנות כדי לחקור את המנגנונים במיוחד של מחלות לב וכלי דם אדם מורכבות הטיפולים האפשריים שלהם, בעבר מעבר להיקף של היכולות שלנו בשל החוסר במודלים של בעלי חיים רלוונטיים ו / או הזמינות של רקמות עיקריות מושפעות.
כל היישומים הנ"ל של hPSCs necessitate לייצור מסיבי של cardiomyocytes מועשר מאוד פונקציונלי. לפיכך, על זמינותו של הפתרון יעיל, לשחזור ומדרגית בפרוטוקול בידול לב במבחנה מתאימה מספר שורות hPSC היא קריטית. פרוטוקולי בידול cardiomyocyte הרווחים כיום מועסקי אסטרטגיות שונות כגון 9 היווצרות גוף embryoid, טכניקות שיתוף תרבות 10, אינדוקציה עם קוקטיילים של ציטוקינים 11 ושיטות תמרת חלבון 12. למרות התקדמות בטכניקות אלה, שרובם עדיין סובלים יעילות עניות, דורשים גורמי גדילה יקרים, או להציע האוניברסליות מוגבלות כאשר מנסים להשתמש קווי hPSC מרובים. עד כה, האתגרים הללו קיימים מגבלות על הייצור של cardiomyocytes hPSC הנגזרות ללימודי טיפול בתאים במודלים של בעלי חיים, כמו גם בתעשיית התרופות לגילוי סמים 13. לכן, הפיתוח של טכניקות חזקות ובמחיר סבירים עבור גדולייצור -scale של cardiomyocytes hPSC נגזרות התפקודי במערכות תרבות מדרגים היה במידה רבה להקל היישומים המסחריים קליניים שלהם.
בכתב היד הזה, אנו מדווחים על הפיתוח של חסכונית מערכת בידול לב משולבת עם יעילות גבוהה, שחזור תחולת hESCs ו hiPSCs המופקת ממגוון מקורות ושיטות תרבות, כוללים שיטה לייצור בקנה המידה הגדולה של מאוד אוכלוסיות מועשרות של cardiomyocytes נגזרת hPSC באמצעות bioreactor. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול זה לקווי hPSC אינו מותאמים מזין תרבית תאים חינם ו / או יחידה, כגון hiPSCs שהוקם או קבוצות גדולות של קווי hPSC רלוונטיים ניתוח של מנגנון מחלה.
Cardiomyocytes נגזר hPSCs הם מקור אטרקטיבי מאוד לשימוש דוגמנות מחלות אנושית, בדיקות הקרנת סמים / רעיל, אולי בעתיד, טיפולים רגנרטיבית. אחד המכשולים העיקריים באמצעות תאים אלה עם זאת, הוא היכולת לספק חומר באיכות גבוהה מספיק עבור השימוש היעיל שלהם. שימוש בפרוטוקול תיאר שלנו, אנו מצ…
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |