Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
تعظيم الاستفادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) للأبحاث، والنمذجة المرض والأدوية والتطبيقات السريرية يتطلب أساليب قوية للإنتاج على نطاق واسع من أنواع الخلايا الوظيفية، بما في ذلك العضلية. هنا علينا أن نظهر أن التلاعب الزمني للWNT، TGF-β، وSHH مسارات إشارات تؤدي إلى خطوط hPSC كفاءة عالية cardiomyocyte تمايز وحيدة الخلية passaged في كل تعليق ثابت وأنظمة التعليق مفاعل حيوي أثار. توظيف هذه الاستراتيجية أدت إلى ~ 100٪ الضرب الكروية، التي تحتوي على الدوام> 80٪ التروبونين القلبي خلايا T إيجابية بعد 15 يوما من الثقافة، والتحقق من صحة في خطوط hPSC متعددة. نفيدكم أيضا على الاختلاف من هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا لم تتكيف حاليا إلى الركض وحيدة الخلية، وقد تم التحقق من نجاح الذي في 42 خطوط hPSC. العضلية تم إنشاؤها باستخدام هذه البروتوكولات التعبير عن علامات-نسب محددة، ومن المتوقع عرض electrophysوظائف iological. يقدم بروتوكول لدينا منصة بسيطة وفعالة وقوية لإنتاج على نطاق واسع العضلية الإنسان.
خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، لديها القدرة على تجديد الذات والقدرة على التمايز إلى خلايا ثلاث طبقات جرثومية جنينية 1،2. ونظرا لهذه الخصائص، وتوفر hPSCs مصدرا قيما وغير محدودة لتوليد وقابلة للإنتاج أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر 3-5، لالإنتاجية العالية فحص المخدرات وسمية المقايسات 6،7 ويحتمل أن تكون للتطبيقات السريرية 8 . جيل الخلايا العضلية من hPSCs يوفر فرصة للتحقيق على وجه التحديد آليات أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية المعقدة والعلاجات الممكنة، في وقت سابق خارج نطاق قدراتنا نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية ذات الصلة و / أو توافر الأنسجة الأساسية المتضررة.
جميع التطبيقات المذكورة أعلاه hPSCs نecessitate إنتاج أعداد هائلة من العضلية عالية التخصيب والوظيفية. وهكذا، فإن توافر الكفاءة واستنساخه وقابلة للتطوير في المختبر بروتوكول تمايز القلب مناسبة لخطوط hPSC متعددة أمر بالغ الأهمية. وقد استخدمت التقليدية بروتوكولات cardiomyocyte التمايز استراتيجيات مختلفة مثل تشكيل هيئة مضغي 9، تقنيات شارك في الثقافة 10، الاستقراء مع الكوكتيلات السيتوكينات 11 و طرق بروتين تنبيغ 12. وعلى الرغم من التقدم في هذه التقنيات، معظمها لا يزال يعاني من ضعف كفاءة، تتطلب عوامل النمو مكلفة، أو تقديم العالمية محدود عند محاولة استخدام خطوط hPSC متعددة. حتى الآن، وقد وضعت هذه التحديات حدود لإنتاج الخلايا العضلية المستمدة hPSC للدراسات العلاج بالخلايا في النماذج الحيوانية، وكذلك في مجال الصناعات الدوائية لاكتشاف الأدوية 13. ولذلك، فإن تطوير تقنيات قوية وبأسعار معقولة لكبيران الانتاج -scale من الوظائف العضلية المستمدة hPSC في أنظمة ثقافة قابلة للتسهيل إلى حد كبير من التطبيقات التجارية والسريرية الخاصة بهم.
في هذه المخطوطة، ونحن التقرير تطور نظام التمايز القلب فعالة من حيث التكلفة ومتكامل مع كفاءة عالية، واستنساخ وتطبيق لhESCs وhiPSCs ولدت من مجموعة متنوعة من المصادر والأساليب الثقافة، بما في ذلك وسيلة لإنتاج على نطاق واسع للغاية السكان المخصب العضلية المستمدة hPSC باستخدام مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، لدينا الأمثل هذا البروتوكول لخطوط hPSC لا تتكيف مع المغذية ثقافة الخلية الحرة و / أو واحدة، مثل hiPSCs المنشأة حديثا أو أفواج كبيرة من خطوط hPSC ذات الصلة لتحليل آلية المرض.
العضلية المستمدة من hPSCs تعتبر مصدرا جذابا للغاية لاستخدامها في نماذج الأمراض التي تصيب البشر، المخدرات فحص / اختبار السمية، وربما في المستقبل، علاجات التجدد. واحدة من العقبات الرئيسية لاستخدام هذه الخلايا ومع ذلك، هو القدرة على توفير ما يكفي من مواد ذات جودة عالية ل?…
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |