The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
Under mitos, är kromosomer replik genomet organiseras på cell ekvatorn för att säkerställa jämn fördelning av systerkromatider över nybildade dottercellerna. Kromosom positionering och segregation förmedlas genom deras fastsättning spindel mikrotubuli som härrör från två motsatta centrosom. Förutom att säkerställa trogen kromosom distribution, orientering den mitotiska spindeln dikterar också celldelningsplanet 1. Samordnad orientering celldelning är viktigt under många utvecklingsstadier och för vävnadshomeostas 2. Specifikt kan regleras mitotiska spindeln positionering resultera i den asymmetriska fördelningen av cellulära innehåll eller ens producera dotterceller av olika storlekar 2. Mitotiska spolen montering och orientering börjar i profas och iscensatt av ett komplext samspel mellan samverkande och motverkande kraft-generatorer 3,4. De genererade krafterna består av Both drag och tryckkrafter. Dessa krafter härstammar både från spindel kontakter med cell cortex liksom inifrån spindeln, och kan genereras av mikrotubuli dynamik samt genom molekylära motorer och tvärbindare (Figur 1).
Tryckkrafterna kan genereras när mikrotubuli växa mot stela strukturer såsom cell cortex. Beroende på den totala motståndskraft som genereras i systemet, kan detta resultera i omplacering av den mitotiska spindeln (låga krafter) eller utlösa mikrotubuli buckling eller katastrof (stora krafter) 5-8. Mängden kraft som kan genereras genom att trycka beror på mikrotubuli längd, eftersom längden är en stark determinant av mikrotubulus-buckling 9. Dessutom kan mikrotubuli som härrör från en centrosom trycka mot den andra centrosom, en mekanism som har föreslagits för att driva centrosom separation i tidig profas 3,10.
i adsättning att driva krafter som genereras genom att odla mikrotubuli, slutar mikrotubulus bringa cellen cortex kan också förmedla dragkrafter 11. Studier från flera laboratorier har visat att den kontrollerade aktiviteten av kortikala kraftgeneratorer krävs för den asymmetriska placeringen av mitotiska spolar in vivo 1. Väsentligt för dessa dragkrafter är cortex-lokaliserad cytoplasma dynein (nedan kallat dynein), ett minus-ände riktad mikrotubuli motorprotein 8,12,13. Till exempel, i knoppande jäst, laterala interaktioner av kortikal dynein med mikrotubuli gitter resulterar i motorberoende mikrotubuli glider längs cortex 14. Emellertid kan kortikala dragkrafter även genereras genom förmågan hos dynein att bilda end-on bilagor till depolymerisera mikrotubuli 8. Den energi som genereras av mikrotubuli krympning kan leda till krafter som är i allmänhet en storleksordning högre (~ 50 PN (referens 15 </supp>)) än de krafter som alstras av enskilda motorproteiner (~ 7-8 pN (ref. 16)). End-on fastsättning av kortikal dynein att depolymerisera mikrotubuli främjar spindelpositioneringen i knoppande jäst 17 och C. elegans 13. Om både motorberoende glidning och mikrotubuli depolymeriseringsprodukter drivs kortikala dragkrafter kan samarbeta eller är ömsesidigt uteslutande in vivo är för närvarande okänd.
Förutom mikrotubuli tryckkrafter och dynein medierad kortikala dragkrafter är centrosom positionering styrs inifrån den mitotiska spindeln av ett stort antal andra proteiner. Kinesin-5 motorer, till exempel, existerar som tetramerer som kan tvärbinda antiparallella interpolar mikrotubuli, vilket resulterar i genereringen av yttre glidkrafter 18-20. Medlemmar av kinesin-5 motor familj krävs för centrosom separation och bipolär spindelenheten i alla eukaryoter studerade med undantag för C. elegans (översikt i referens 21).
Vidare är diffunderbara tvärbindare av Ase1 / PRC1 familjen också kända för att lokalisera till överlappande mikrotubuli regioner av interpolar mikrotubuli in vivo och in vitro 22-27. De krafter som alstras Ase1 driven expansion av den överlappande mikrotubuli-regionen är tillräckligt stor för att uppväga kinesin-14 förmedlade glid krafter in vitro 28,29. I celler, är Ase1 / PRC1 krävs för stabil bildning av överlappande mikrotubuli regioner i spindel mellanzon 25-27,30, vilket tyder på att de krafter som alstras diffunderbara tvärbindare kan bidra avsevärt till spindel organisation. Slutligen styrkor från den mitotiska kromatin och kinetokorer påverkar mitotiska spindelenhet och positionering via olika vägar 3. Eftersom dessa komponenter är inte en del av beredning analyser som beskrivs här, kommer de inte att diskuteras i detalj.
jove_content "> Olika teorier finns om hur de olika molekylära komponenter och krafter som beskrivs ovan samarbeta spindelenhet och positionering, men vi är fortfarande långt ifrån en kvantitativ förståelse. Förutom försök i levande celler, experiment in vitro med renade komponenter ger en kraftfull väg för att nå detta mål. här presenterar vi en visuell guide till en anpassad och utökad version av den nyligen publicerade metoder (Roth et al. 31), i vilken grund spindlar rekonstitueras i vatten-i-olja emulsionsdroppar, som börjar med en minimalt antal komponenter. Använda mikroflödesteknik, är sfäriska droppar genereras med storlekar som är jämförbara med mitotiska celler. inom dessa droppar, kan renade centrosom och tubulin kombineras för att studera mikrotubuli aster dynamik, styrke och aster-aster interaktioner. Genom införa kortikala (såsom dynein) och inter-polära (t.ex. kinesin-5 / Ase1) kraftgeneratorer, virekonstruera allt mer komplexa spindelliknande strukturer som börjar likna in vivo situationen.De metoder som beskrivs här före senaste ansträngningar för att återupprätta grundläggande mitotiska spindlar i vatten-i-olja emulsionsdroppar. Studera spindelenhet inom geometriska gränser ger många fördelar. Viktiga återkopplingsmekanismer föreligger mellan mikrotubuli av den mitotiska spindeln och de geometriska begränsningar som de är monterade. Mikrotubuli kan generera tryckkrafter när de växer i geometriska gränser, vilket kan resultera i mitotiska spindelförskjutning. Dessutom kan växa till en fysisk barriär inducera mikrotubuli katastrofer. Dessutom kan spindelenhet inom ett begränsat geometri leda till en gradvis utarmning av individuella komponenter, såsom tubulin, som i sin tur direkt påverkar mikrotubuli tillväxthastigheten 36. Dessa är alla viktiga faktorer för spindelenhet, som kan studeras med användning av de analyser som beskrivs här.
De beskrivna analyser är mycket känsliga för liten koncentration differeNCES av droppen komponenter. Detta är fallet för tubulin, där små skillnader koncentrations kan resultera i antingen alltför långsam eller alltför snabb mikrotubuli tillväxt. I detta fall, mikrotubuli tillväxthastigheter kan ofta fortfarande korrigeras genom att justera temperaturen under det första ~ 30 min av försöket. Mitotiska spolen montering och positionering är också mycket känslig för variationer i koncentrationen av (kortikal) kraftgeneratorer. Detta kommer sannolikt att bero på koncentration, renhet och aktiviteten hos de renade komponenterna och måste titreras noggrant för varje nyligen renade proteinet.
Dessutom har vissa kompromisser måste göras i avbildnings inställningar, beroende på analysens natur. Initialt höga halter av lösliga fluorescerande tubulindimerer gör det svårt att avbilda enskilda mikrotubuli. Som mikrotubuli växer längre och löslig tubulin långsamt utarmat, gradvis blir signal-till-brusförhållandet högre och medger avbildning av individual mikrotubuli. I motsats till inställningar med öppna system, förhindrar den geometriska förlossning utbyte av fluorescerande molekyler och syre renhållare systemkomponenter inom en bulkreservoar, vilket resulterar i betydande blekning. Speciellt för övervakning av spindel montering och positionering över tid, krävs det att bilden med låga Ijusintensiteter, även i närvaro av en potent syrefångare system.
Dessa metoder gör det möjligt för bottom-up beredning av förenklade spindelliknande strukturer in vitro. Förutom de komponenter införda här, har många andra faktorer beskrivits påverka bipolär spindelbildning, positionering, orientering, formning, etc. 3. Detta system kan utökas ytterligare för att studera enskilda och kombinerade effekterna av ytterligare kraft generatorer. Viktiga bidrag till spindel formation som för närvarande är frånvarande från detta system är de mitotiska kromosomer. Mitotisk kromatin har visat sigdirekt spindelbildning genom (1) chromokinesins som kan generera så kallade polära ejektionskrafter "3, (2) bildandet av en RanGTP gradient av kromatin-bundna RanGEF RCC1 38, (3) kinetokorer som kan interagera med (depolymerisera ) mikrotubuli 39 och (4) kromatinet självt, vilket kan fungera som en mekanisk fjäder i-mellan motsatta mikrotubuli 40.
Slutligen ger det beskrivna systemet för närvarande begränsad i tid och rum kontroll över verksamheten och lokalisering av införda kraftgeneratorer. I celler, många spindelmonterings faktorer lokalisera specifika avdelningar eller är verksamma inom en begränsad tid fönster. Ett slående exempel är aktiviteten hos dynein, som specifikt är berikad på den bakre sidan av den C. elegans en-cells stadiet embryo att främja asymmetrisk spindelpositionering och celldelning. I detta system, vi undersöker för närvarande möjligheten att imitera sådan temporal och asymmetriska aktivitet med hjälp av metoder lånade från opto-genteknik. Dessutom, såsom är fallet för C. elegans embryo och celler med en styv cellvägg, gör många celler inte runda upp i mitos. Formen på den geometriska inneslutning kommer att ha en avgörande inverkan på de krafter som verkar på spindeln 41. Det kommer därför att vara viktigt att man bereder spindelenhet och placering i icke-sfäriska droppar samt potentiellt använda mer komplexa mikroflödessystem som tillåter formning och lagring av emulsionsdropparna 42,43. Slutligen, i vävnader, cell-cell och cell-substrat signalering och fastsättning tillhandahålla externa signaler som kan översättas till riktade spindelorientering, som ofta observeras i epitelceller och stamceller. Alla dessa specialiserade aspekter har inte beaktats i denna studie och kan ge framtida utmaningar för att bygga mot mer in vivo -liknande reconstitutions av mitotiska spindeln assembly och positionering.
The authors have nothing to disclose.
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
1. Preparation of microfluidic chips | |||
Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
SU-8 3025 | MicroChem | ||
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
Spin coater | Polos | SPIN150I | |
PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
2. Microfluidic setup | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
Glass pipets | |||
Glass tubes | |||
Vacuum pump | Laboport | KNF | |
Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
Sonicator | Branson | M2800H | |
Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
Glass-slides | 26x76mm | ||
Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
Laboratory sealing film | Parafilm | ||
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
4. Introducing spindle-assembly factors | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |