In Vitro Проникновение ФИТЦ-нагруженных ферритинов через Rat гематоэнцефалический барьер: модель для изучения Поставка Nanoformulated Molecules
Summary
A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.
Abstract
Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.
Introduction
Сопротивление центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания (т.е.. Рак, эпилепсия, депрессия, шизофрения и ВИЧ-ассоциированные неврологические расстройства) к фармакологической терапии из – за различных различных механизмов, в том числе трудного проникание лекарственного средства через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) , ВВВ является границей, которая изолирует ткани мозга от веществ, циркулирующих в крови. В пределах этого барьера, слой мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs), поддержанный перицитов и астроцитов endfeet, отвечает за высокой селективности ВВВ до тех водорастворимыми препаратами с молекулярной массой выше , чем 400 Да 1. Другой механизм сопротивления , связанное с наркотиками связано с наличием на BMECs истече- наркотиков транспортеров (Р-гликопротеина и множественной лекарственной устойчивости белков), которые сотрудничают с целью уменьшения проникновения наркотиков в ЦНС и облегчить их выдавливание из мозга 2.
В последнее десятилетие, Большое количество нанотехнологических подходов были разработаны для удовлетворения клинической и биологической проблемой доставки лекарств через ВВВ 3-6. В этом контексте, ферритин наносферы (БНС) представляют собой совершенно инновационное и перспективное решение. FNn 12 нм сферы 24 самосборки ферритина (Fn) мономеров, которые расположены в полой сферической структуре 8 нм внутреннего диаметра. Ферритина субъединиц могут быть разобраны при кислом рН и вновь в моде памяти формы путем доведения рН до нейтральности, позволяя различные органические молекулы быть воплощен. Поэтому БНС представляют собой интересную модель для развития многофункциональной системы доставки лекарственных средств 7,8. Кроме того, БНС может взаимодействовать с BMECs благодаря специфическим узнаванием рецептора трансферрина (TfR) 1, который экспрессируется на полостной мембране этих клеток 9.
До сих пор, по- разному в пробирке моделей ГЭБ были разработаны в Ordeг выяснить транс-ВВВ проницаемость для различных препаратов, токсичность по отношению к ВВВ, или взаимодействия молекул с эффлюксных транспортеров. Действительно, эти модели считаются действительными в пробирке подходы для быстрого скрининга активных молекул , прежде чем приступить к исследованиям в естественных условиях. Эти модели состоят из одного эндотелиального слоя BMECs или совместно культивировали BMECs и астроцитов (реже перицитов), полученные от животных (крысы, мыши, свиньи и бычий) или клеточные линии человека 10,11,12. Трансэндотелиальную Электрическое сопротивление (TEER) и кажущаяся проницаемость (P приложение) трассеров с определенной молекулярной массой представляют собой две критические параметры, которые используются для определения качества модели в пробирке. Здесь мы описываем занятость в ВВВ модели в пробирке, основанный на совместной культуре крысы BMECs (RBMECs) и коры головного мозга крыс астроциты (Rcas) для изучения транс-ВВВ проникания ферритина наноклеток заключающую флуоресцеина isothiocyanate (FITC).
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод в пробирке , описанный здесь представляет собой полезный подтвержденный подход к изучению доставки транс-ВВВ флуоресцентных молекул при nanoformulation с наночастицами. Здесь мы используем БНС, который представляет собой хороший кандидат для изучения транслокации молекул грузов …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia and Sacco Hospital (NanoMeDia Project) for research funding.
Materials
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE |
Referências
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -. T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
