الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة
Summary
توضح هذه المخطوطة تقنية القائم على الطباعة الحجرية الناعمة لهندسة صفائف موحدة للثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة الطلائية للهندسة المعرفة وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية. هذا الأسلوب هو قابل للمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والسياقات التجريبية ويسمح لفحص عالية الإنتاجية من مكررات متطابقة.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
تطوير الأنسجة الظهارية تشعبت، والمعروفة باسم المتفرعة التشكل، وينظم من قبل، والعوامل البيئية المادية المستمدة من الخلية. في الغدة الثديية، المتفرعة التشكل هو عملية تكرارية من خلالها الموجهة الهجرة الخلية الجماعية تخلق بنية تشبه شجرة. الخطوة الأولى هي تشكيل برعم الأساسي من قنوات الحليب، تليها بدء فرع واستطالة 1،2. وبفعل غزو فروع في سدى المحيطة الإفراج النظامية من هرمونات الستيرويد في سن البلوغ. ثم بدء براعم ابتدائية جديدة من نهايات الفروع القائمة، وتستمر هذه العملية لإنشاء شجرة الظهارية 3. على الرغم من أن تم التعرف على العديد من الإشارات البيوكيميائية المهمة، فهم شامل لآليات الخلية البيولوجية التي توجه هذه العملية التنموية المعقدة تفتقر حاليا. وعلاوة على ذلك، دراسات الميكانيكية على تأثيرات منبهات معينة يصعب تفكيك من من experiالإدلاء بالبيانات في الجسم الحي، اضطرابات والقياسات الزمانية المكانية كما دقيقة وغالبا ما تكون غير ممكنة.
ثلاثي الأبعاد (3D) تقنيات زراعة، مثل ثقافة بأكملها الجهاز، organoids الابتدائي، ونماذج ثقافة الخلية، أدوات مفيدة للتحقيق منهجي الآليات الكامنة التشكل الأنسجة 4-6. هذه يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتحديد تأثيرات عوامل محددة بشكل فردي، مثل القوى الميكانيكية والإشارات البيوكيميائية، على مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلية، بما في ذلك الهجرة، والانتشار، والتمايز. 6 المهندسة نماذج ثقافة الخلية، على وجه الخصوص، تمكن بسهولة اضطراب من الخلايا الفردية والمكروية بهم.
يستخدم نموذج واحد ثقافة هذا النهج القائم على التصنيع الدقيق لهندسة الأنسجة الظهارية الثديية نموذجية مع هيكل 3D للرقابة التي تشكل على الدوام وبتكاثر الفروع التي تهاجر بشكل جماعي عندما الناجم مع لعوامل النمو ppropriate. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو القدرة على التعامل بدقة وقياس آثار العوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية، مثل أنماط من إجهاد، مع الثقة إحصائية عالية. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع النمذجة الحاسوبية، وقد تم بالفعل تستخدم لتحديد المساهمات النسبية للإشارات الجسدية والكيميائية الحيوية في توجيه التطور الطبيعي للأنسجة الظهارية الثديية وغيرها من ظهائر متفرعة 7-11. المقدمة هنا هو بروتوكول مفصلة لبناء هذه الأنسجة النموذج، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى أنواع أخرى من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمواد الهلامية، والتي هي بمثابة أداة محتملة لاختبار العلاجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL118532، HL120142، CA187692)، ومؤسسة ديفيد وولوسيل باكارد، وكميل ومؤسسة هنري دريفوس، وبوروز مرحبا صندوق. وأيد ASP في جزء من شارلوت إليزابيث بروكتر شرفية زمالة.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
Referências
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
