इंजीनियरिंग तीन आयामी उपकला ऊतकों कोशिकी मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड
Summary
यह पांडुलिपि एक नरम लिथोग्राफी आधारित तीन आयामी (3 डी) की वर्दी सरणियों परिभाषित ज्यामिति की उपकला ऊतकों बाह्य मैट्रिक्स से घिरा इंजीनियर करने के लिए तकनीक का वर्णन करता है। इस विधि प्रकार की कोशिकाओं और प्रयोगात्मक संदर्भों की एक विस्तृत विविधता के लिए उत्तरदायी है और समान प्रतिकृति के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है।
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
branched उपकला ऊतकों, morphogenesis शाखाओं में बंटी के रूप में जाना के विकास, सेल व्युत्पन्न, शारीरिक, और पर्यावरणीय कारकों द्वारा विनियमित है। स्तन ग्रंथि में, शाखाओं में बंटी morphogenesis चलने का एक प्रक्रिया है जो निर्देशित के माध्यम से सामूहिक सेल प्रवास एक पेड़ की तरह वास्तुकला बनाता है। पहला कदम दुग्ध नलिकाओं से प्राथमिक कली गठन, शाखा दीक्षा और बढ़ाव 1,2 द्वारा पीछा किया। आसपास के स्ट्रोमा में शाखाओं का आक्रमण यौवन पर स्टेरॉयड हार्मोन के प्रणालीगत रिलीज से प्रेरित है। न्यू प्राथमिक कलियों तो मौजूदा शाखाओं की छोर से आरंभ, और इस प्रक्रिया को एक उपकला पेड़ 3 बनाने के लिए जारी है। हालांकि कई महत्वपूर्ण जैव रासायनिक संकेतों पहचान की गई है, कि इस जटिल विकास की प्रक्रिया वर्तमान में कमी है मार्गदर्शन सेल जैविक तंत्र के लिए एक व्यापक समझ। इसके अलावा, विशिष्ट संकेतों के प्रभावों पर यंत्रवत अध्ययनों के अनुभव से deconstruct करने के लिए मुश्किल हो जाता हैविवो में बयान, के रूप में सटीक spatiotemporal perturbations और माप अक्सर संभव नहीं हैं।
इस तरह पूरे अंग संस्कृति, प्राथमिक organoids, और सेल संस्कृति मॉडल के रूप में तीन आयामी (3 डी) संस्कृति तकनीक, व्यवस्थित तंत्र ऊतक morphogenesis 4-6 अंतर्निहित की जांच के लिए उपयोगी उपकरण हैं। ये ऐसे यांत्रिक बलों और जैव रासायनिक संकेतों के रूप में व्यक्तिगत रूप से विशिष्ट कारकों के प्रभाव का निर्धारण करने, सहित प्रवास, प्रसार, और भेदभाव सेल व्यवहार की एक किस्म के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। 6 इंजीनियर सेल संस्कृति मॉडल, विशेष रूप से, आसानी से गड़बड़ी सक्षम व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके microenvironment के।
ऐसा ही एक संस्कृति मॉडल नियंत्रित 3 डी संरचना के साथ मॉडल स्तन उपकला ऊतकों जब एक साथ प्रेरित है कि लगातार और reproducibly शाखाओं कि सामूहिक रूप से विस्थापित फार्म इंजीनियर को एक microfabrication आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता हैppropriate वृद्धि कारक है। मॉडल का प्रमुख लाभ ठीक हेरफेर और इस तरह के यांत्रिक तनाव के पैटर्न, उच्च सांख्यिकीय विश्वास के साथ के रूप में शारीरिक और जैव रासायनिक कारकों के प्रभाव को मापने की क्षमता है। इस तकनीक को एक साथ कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के साथ, पहले से ही स्तन उपकला ऊतकों और अन्य शाखाओं epithelia 7-11 के सामान्य विकास के मार्गदर्शन में शारीरिक और जैव रासायनिक संकेतों के रिश्तेदार योगदान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ प्रस्तुत इन मॉडल के ऊतकों, जो आसानी से कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जैल के अन्य प्रकारों के लिए बढ़ाया जा सकता है के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है, और जो चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में कार्य करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच (HL118532, HL120142, CA187692), डेविड और Lucile Packard फाउंडेशन, केमिली और हेनरी Dreyfus फाउंडेशन, और बरोज से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था आपका स्वागत फंड। एएसपी एक शेर्लोट एलिजाबेथ प्रोक्टर माननीय फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
Referências
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