Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare
Summary
Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
Lo sviluppo dei tessuti epiteliali ramificati, noto come ramificazione morfogenesi, è regolata da, e fattori ambientali fisici derivati dalle cellule. Nella ghiandola mammaria, branching morfogenesi è un processo iterativo attraverso il quale guidata migrazione cellulare collettiva crea un'architettura ad albero. Il primo passo è la formazione gemma primaria dai condotti del latte, seguita da iniziazione ramo e l'allungamento 1,2. Invasione delle filiali in stroma circostante è indotta dal rilascio sistemico di ormoni steroidei alla pubertà. Nuovi germogli primarie poi iniziano dalle estremità dei rami esistenti, e questo processo continua a creare un albero epiteliale 3. Anche se molti importanti segnali biochimici sono state identificate, una comprensione globale dei meccanismi cellulari biologici che guidano questo complesso processo di sviluppo è attualmente carente. Inoltre, gli studi meccanicistici sulle influenze dei segnali specifici sono difficili da decostruire da esperimentimenti in vivo, come precisi perturbazioni spazio-temporali e misure spesso non sono possibili.
Tridimensionali (3D) le tecniche di coltura, quali la cultura tutto l'organo, organoidi primarie, e modelli di coltura cellulare, sono strumenti utili per indagare in modo sistematico i meccanismi alla base del tessuto morfogenesi 4-6. Questi possono essere particolarmente utile per determinare le influenze di fattori specifici singolarmente, ad esempio forze meccaniche e segnali biochimici, su una varietà di comportamenti cellulari, compresa la migrazione, la proliferazione e la differenziazione. 6 modelli di coltura cellulare Engineered, in particolare, facilmente abilitare la perturbazione delle singole cellule e loro microambiente.
Un tale modello di coltura utilizza un approccio microfabbricazione-based per ingegnerizzare modello tessuti epiteliali mammarie con struttura 3D controllato che in modo coerente e riproducibile formano rami che migrano collettivamente quando indotto con l'unafattori di crescita ppropriate. Il principale vantaggio del modello è la capacità di manipolare e misurare gli effetti di fattori fisici e biochimici, come modelli di stress meccanico, con elevata affidabilità statistica precisione. Questa tecnica, insieme alla modellizzazione computazionale, è già stato utilizzato per determinare il contributo relativo di segnali fisici e biochimici nel guida del normale sviluppo dei tessuti epiteliali mammarie e di altri epiteli ramificati 7-11. Qui presentato è un protocollo dettagliato per la costruzione di questi tessuti modello, che possono essere facilmente estese ad altri tipi di cellule e della matrice extracellulare (ECM) gel, e che serve come un potenziale strumento per il test di terapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), il Packard Fondazione David e Lucile, la Camille & Henry Dreyfus Foundation, e la Burroughs Welcome Fondo. ASP è stato sostenuto in parte da un Charlotte Elizabeth Procter onorifico Fellowship.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
Referências
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