성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
후근 신경절에서 패치 클램프 연구 (DRGs) 신경 세포는 말초 신경계에 대한 우리의 이해를 증가하고있다. 현재 녹음의 대부분은 대부분의 실험실에 대한 표준 준비입니다 해리 DRG 뉴런에 실시하고 있습니다. 신경 특성 그러나, 해리 뉴런 취득에 사용 된 효소 분해로 인한 축삭 손상에 의해 변경 될 수있다. 기본 감각 뉴런을 둘러싸 위성 아교 세포와 접촉의 손실이 방법의 피할 수없는 결과이기 때문에 또한, 해리 신경 준비는 완벽하게 DRG의 미세 환경을 대표 할 수 없습니다. 이 보고서에서, 패치 클램프 녹음을 위해 기존의 해리 DRG 뉴런을 사용하여 한계를 극복하기 위해 우리는 그대로 DRGs를 준비하고 각각의 기본 감각 뉴런 생체에 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식의 흉내 그대로 DRGs의 빠르고 간단한 준비를 허용그 주변 위성 신경교 세포 기저막과 연관된 DRG 뉴런 유지하여 생체 내 조건. 또한,이 방법은 조작에서 축삭 손상을 방지하며 DRGs 해리 때와 같이 소화 효소. 이 생체 제제는 별도로 차 감각 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다.
Introduction
감각은 유기체의 생존과 복지에 필수적이다. 자극의 전달은 일차 감각 신경 세포의 축삭 외주 말단부터 감각 경로에 의존한다. 차 감각 뉴런, 삼차 신경의 중뇌 핵 제외한 삼차 신경절 및 후근 신경절 (DRGs)에 위치하고있다. 그들은 감각 정보 1의 게이트 키퍼 역할을합니다. perikarial 막에서 바로 중추 및 말초 말단에 같은 DRG 뉴런 등 글루타메이트 수용체, TNF 알파 수용체 일과성 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1), 나트륨 채널이 같은 수용체 이온 채널을 표현할 -7. perikarial 막 패치 클램프 녹음은 신경 세포에 걸쳐 이들 수용체 및 채널의 많은 기능 변화를 이해 할 수 있습니다.
패치 클램프 녹음 기술은 스투위한 강력한 도구입니다채널 또는 수용체 연구 다수의 활동 죽는 것은 DRG 뉴런 8-10에이 기술을 적용함으로써 수행되었다. 대부분의 연구에서 DRG는 지느러미 작은 뿌리와 신경절에 척추 신경 주변을 절단하여 제거한다. 닦지 후 신경절 후 다음 기록 이전에 수일 동안 배양 즉시 또는 기록 될 수있다 DRG 뉴런의 해리 될 소화 효소에 배치된다. 불행하게도, DRG 뉴런의 분리는 perikarya에 가까운 필요한 axotomy을 포함한다. 일단 해리와 axotomized, DRG 뉴런은 막 흥분 11, 12에서 표현형의 변화뿐만 아니라 변화를 겪는다. 일반적으로 그들을 둘러싸는 개별 뉴런 perikarya 및 위성 신경교 세포 사이의 접촉의 감소는 이러한 변경 13에 기여할 것으로 예상된다. 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 크로스 토크는 생리 학적 조건에서 필수적이고 patholog 적응 모두 인같은 난치성 통증 14, 15로 이어지는 것과 같은 iCal의 조건. 해리 DRG 제제를 사용하여 신경 교세포와 위성 사이의 상호 작용을 연구하기가 어려울 것이다.
그대로 DRGs, 다른 한편으로는, 생체 상태에 가깝게 제공한다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험뿐만 아니라 다른 그룹은 만성 통증 3-5,11,15-17와 관련된 다양한 조건의 차 감각 뉴런의 변화를 조사하기 위해 성인 쥐에서 그대로 DRGs를 사용하고있다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 어느 정도 성립하지만, 단계별 설명은 아직 출판되지 않았다. 본 원고에서는 그대로 DRGs 및 패치 클램프 녹음에 대한 사용을 준비하는 편리하고 빠른 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 패치 클램프 연구 전체 DRGs을 제조하는 방법을보고한다. 이상적인 표본을 준비하기위한 몇 가지 핵심 요소가 있습니다. 첫째, 부착 등의 뿌리와 DRGs를 해부하는 것이 중요하다. 그 후, epineurium은 신경의 손상을 방지하면서 조심스럽게 제거해야한다. 마지막으로, 신경 세포 및 그 주변 위성 신경교 세포를 노출 시키도록, 상기 나머지 결합 조직을 소화 할 필요가있다. 여기에 기술 된 방법으?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
Referências
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