Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

Resumo

Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.

Resumo

FINA, filtração isolamento de ácidos nucleicos, é um método de extracção que utiliza filtração romance vertical, através de uma membrana de separação e uma almofada absorvente para extrair ADN celular do sangue total em menos de 2 min. A amostra de sangue é tratada com o detergente, misturada brevemente e aplicada por uma pipeta para a membrana de separação. O lisado pavios para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície da membrana de separação. O DNA extraído é retida na membrana durante um simples passo de lavagem em que inibidores da PCR são maus para o mata-borrão absorvente. A membrana contendo o ADN retido é então adicionado à reacção de PCR sem purificação adicional. Este método simples não requer equipamento laboratorial e pode ser facilmente implementado com material de laboratório de baixo custo. Descrevemos aqui um protocolo para a detecção altamente sensível e quantificação do VIH-1 ADN proviral de 100 ul de sangue inteiro como um modelo para o iníciofant diagnóstico do HIV que pode ser facilmente adaptada a outros alvos genéticos.

Introdução

Vários relatórios têm discutido o desenvolvimento de métodos de extracção aplicada sobre papel ou à base de membrana para uso em point-of-care (POC) dispositivos ^1-5 com o objectivo de tornar a requintada sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular disponíveis para todos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) Doenças Sexualmente Transmissíveis Diagnostics Iniciativa cunhou o termo assegurada (, sensível, específico, rápido e robusto, livre de Equipamentos e entregue a quem precisa fácil utilização acessível) para descrever as características ideais de um POC teste ^6. Destas orientações, a característica livre de equipamento é particul....

Protocolo

declaração de ética: amostras de sangue total utilizados neste estudo não são considerados pesquisa envolvendo seres humanos. Os espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico clínico, que foram satisfeitos, eo restante destes espécimes foi fornecido para o ensaio de pesquisa FINA. As amostras foram codificadas de modo a que os investigadores não foram capazes de determinar facilmente a identidade dos indivíduos.

1. Preparação da FINA Amostra Módulo Preparação

1. Prepare absorvente pad cortando um 35 x 35 mm ² de um 2,6 mm de espessura almofada de algodão 100%. Corte um pad por espécime.
2. Prepare a película de parafina de plástic....

Resultados

O fluxo de trabalho para a extracção de ADN proviral de sangue total enriquecida com células 8E5-VAE é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra o módulo da amostra FINA e preparado tubo qPCR. Este método permite a amplificação eficiente de VIH-1 a partir de células pró-vírus LAV-8E5 em diferentes números de cópias, tal como mostrado na curva padrão de espécimes artificiais (Figura 3). PCR teve uma eficiência de 103%, como calculado a part.......

Discussão

EID ligada ao acesso rápido tratamento foi demonstrada para reduzir a mortalidade infantil devido à infecção pelo HIV ^16. Devido à persistência de anticorpos maternos no sangue de uma criança, os testes rápidos anti-HIV têm utilidade limitada para determinar o status de crianças expostas ao HIV. A OMS recomenda que todas as crianças nascidas de mães HIV-1 positivas devem ser testados em 4-6 semanas de idade, usando um teste virológico ^17. Nós relataram o desenvolvimento de um ensaio para a detecção.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fusion 5	GE Healthcare Life Sciences	8151-9915
707 almofada de mata-borrão	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR International	52858-000
Fita de Diagnóstico de Poliéster Dupla Face 3M	3M Medical Specialties	9965
200 µ l tubos de tira qPCR	Agilent	401428
tampas de tira óptica	Agilent	401425
Mx3005p qPCR	System Agilent	401456
hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. Reagente
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
dimetil sulfóxido	Sigma-Aldrich	D8418	para biologia molecular
soro fetal bovino, certificado, origem americana	Thermo Fisher Scientific	16000-044
Furador pequeno acionado por martelo Diâmetro do furo de 3/16" (5,1 mm)	McMaster Carr	3424A16
Furador pequeno acionado por martelo Diâmetro do furo de 1/4" (7,14 mm)	McMaster Carr	3424A19
Furador pequeno acionado por martelo Diâmetro do furo de 5/16" (8,35 mm)	McMaster Carr	3424A23