Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.
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Artigo de método
Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A proteína estrutural do VIH-1, Pr55 da mordaça (ou GAG), liga-se à membrana plasmática em células durante o processo de montagem do vírus. ligação de Gag membrana é um passo essencial para a formação de partículas de vírus, uma vez que um defeito no resultado de ligação à membrana da mordaça em grave comprometimento da produção de partículas virais. Para obter detalhes mecanísticos de interacções da membrana Gag-lipídicos, e métodos in vitro com base em RMN, a pegada de proteína, ressonância de plasma de superfície, a centrifugação dos lipossomas de flutuação, ou grânulo fluorescência ligação de lípidos têm sido desenvolvidos até agora. No entanto, cada um destes métodos in vitro tem as suas limitações. Para ultrapassar algumas destas limitações e proporcionar uma abordagem complementar com os métodos previamente estabelecidos, foi desenvolvido um ensaio in vitro em que as interacções entre o HIV-1 gag e membranas lipídicas ter lugar num ambiente de "célula-like". Neste ensaio, Gag ligação a membranas lipídicas é visualmente analisadas usando-YFP Tagged Gag sintetizado em um germe de trigo baseada no sistema de tradução in vitro e GUVs preparados por uma técnica da eletroformação. Aqui nós descrevemos os antecedentes e os protocolos para obtenção de proteínas da mordaça completos com ácido mirístico e membranas GUV necessárias para o ensaio e para detectar Gag-GUV ligação por microscopia.
Introdução
vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é um vírus com envelope que monta a e gomos a partir da membrana plasmática (PM) na maior parte dos tipos de células. A montagem do HIV-1 partículas de vírus é conduzida por a proteína de núcleo virai de 55 kDa chamado Pr55 Gag (GAG). Gag é sintetizado como um precursor de poliproteina composto por quatro domínios estruturais principais, isto é, matriz, da cápside, nucleocápside, e P6, bem como dois péptidos espaçadores SP1 e SP2. Durante a montagem, o (MA) de domínio matriz é responsável pelo direcionamento de mordaça para o local de montagem, o capsídeo (CA) de domínio medeia interações-Gag Gag, o (NC) de d....
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Protocolo
Dia 1: Expressão de mordaça proteínas utilizando a transcrição in vitro-translation sistema baseado em Lysate germe de trigo
1. Preparação do HIV-1 Gag
- Remove todos os reagentes do kit comercial CECF de gérmen de trigo a partir de congeladores (lisados de gérmen de trigo são armazenadas a -80 ° C; outros reagentes, a -20 ºC). Descongelar-los em gelo e misturar os componentes como apresentados na Tabela 1.
| Mix-1 (alimentação mix) | |
| solução de alim.... |
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Resultados
Usando o protocolo acima, preparamos GUVs compostos por POPC + + POPS Chol (razão molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composição foi escolhida para aproximadamente reflectir as concentrações de colesterol e de PS PM. Robusto e eficiente ligação de Gag foi observada somente quando o cérebro-PI (4,5) P 2 foi incluída na mistura POPC + POPS + Chol-PI cerebral (4,5) P 2 [razão molar (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1], neste exemplo) (Figura 4, comparar o.......
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Discussão
O ensaio de ligação GUV como descrito acima fornece uma boa alternativa em situações onde outros ensaios de interação proteína-lipídica têm as suas limitações. Este ensaio nos permite examinar as interações entre ácido mirístico Gag de corpo inteiro e lipídios ácidos com cadeias acilo de comprimento nativa no contexto bicamada lipídica e fazê-lo sem longas centrifugação flotação por meio de alta densidade gradientes de sacarose ou outro processamento pós-obrigatório de Gag-lipídico complexos. Outra vantagem é que o comp.......
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Divulgações
Declaramos que não temos interesses conflitantes.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de agradecer Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan para discussões úteis. Agradecemos também Priya Begani de assistência durante as filmagens. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 AI071727 (para AO) e R01 GM110052 (a SLV).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Multímetro Digital | Meterman | 30XR | Um multímetro genérico que pode medir resistência e volts servirá ao propósito. |
| Gerador de função | Instek | GFG-8216A | Um gerador de função genérico capaz de gerar uma onda senoidal a 10 Hz e 1 V é suficiente. |
| Lâminas de vidro revestidas com ITO | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubadora | Hoefer | Qualquer incubadora que possa manter a temperatura com precisão será suficiente | |
| Câmara de vácuo | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Seringa | Hamilton | 80400 | Calibre 22S, número da seringa 702 |
| Kit de base de elastômero PDMS Sylgard, Dow-Corning | Sylgard, 184 | ||
| RTS 100 Kit CECF de Gérmen de Trigo | BiotechRabbit, Berlim, Alemanha | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Lipídios Polares, Alabastro, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Lipídios Polares | 840034C | |
| Colesterol | Avanti Lipídios Polares | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Lipídios Polares | Avanti 840046X |
Referências
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
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Reimpressões e permissões
