एक उच्च सामग्री<em> इन विट्रो</em> अग्नाशय आइलेट β-सेल प्रतिकृति डिस्कवरी प्लेटफार्म
Summary
मधुमेह अनुसंधान के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों आणविक तंत्र है कि आइलेट β-सेल प्रतिकृति को विनियमित करने और β-सेल पुनर्जनन उत्तेजक के लिए तरीकों को विकसित करने के लिए समझने के लिए कर रहे हैं। इस के साथ साथ एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विधि की पहचान करने और आकलन छोटे अणुओं के β-सेल प्रतिकृति को बढ़ावा देने गतिविधि प्रस्तुत किया है।
Abstract
Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.
Introduction
मधुमेह बाधित ग्लूकोज homeostasis के आम अंत बिंदु बांटने के विकारों का एक संग्रह शामिल हैं। हालांकि मधुमेह उपप्रकार के रोगजनक तंत्र अलग कर रहे हैं, वे कम β-कोशिका द्रव्यमान है, यानी, इंसुलिन उत्पादन क्षमता 1,2 के नुकसान के परिणाम का हिस्सा है। वर्तमान में, मधुमेह उपचार रणनीतियों बहिर्जात इंसुलिन, इंसुलिन के उत्पादन या इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि की pharmacologic उत्तेजना की पुरानी प्रशासन पर भरोसा करते हैं, और शायद ही कभी, अग्नाशय के टापू या पूरे अग्न्याशय 3,4 के प्रत्यारोपण। अफसोस, इन रणनीतियों की सफलता कम रहता है और / या पर्याप्त अंतर्जात इंसुलिन के उत्पादन के समारोह पुनरावृत्ति करने में विफल रहता। β-सेल पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने के लिए एक विधि को विकसित करने की उपयोगिता के बावजूद, इस तरह का कोई दृष्टिकोण से मौजूद है। नतीजतन, एक प्रमुख मधुमेह अनुसंधान लक्ष्य तरीकों को विकसित करने के लिए नए-β कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए या अंतर्जात β-सेल जन 5 का विस्तार करने के लिए है </sup>। हालांकि इस तरह के भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रूप में अक्षय स्रोतों से β-सेल पुनर्जनन आगे बढ़ रहा है, सुरक्षा और दक्षता चिंताओं परिपक्व β-कोशिकाओं के विस्तार, एक प्राथमिकता 6.7 सहित वैकल्पिक रणनीतियों, का पीछा करते हैं। महत्वपूर्ण बात है, विवो में नए β-कोशिकाओं का प्रमुख स्रोत पूर्व मौजूदा विशेष पूर्वज कोशिकाओं 8,9 β-कोशिकाओं के बजाय है। हालांकि β कोशिकाओं सीमित प्रतिकृति क्षमता, β-सेल मास में एक छोटे से वृद्धि दिखाई देते हैं (~ 30%) कई मधुमेह रोगियों में ग्लूकोज homeostasis बहाल करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। इसके अलावा, β-सेल मास के सीटू pharmacologic उत्तेजना में एक संभावित सस्ती और स्केलेबल उपचार की रणनीति है। इस के साथ साथ की पहचान करने और छोटे अणुओं है कि β-सेल के विकास को प्रोत्साहित निस्र्पक के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विधि प्रस्तुत किया है।
इन विट्रो प्रयोगात्मक विधियों की एक किस्म जीन उत्पादों और / या अणुओं Tha की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैटी प्राथमिक β-सेल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के। Β-सेल प्रतिकृति प्रेरण को मापने के लिए प्रारंभिक प्रयासों, भ्रूण कृंतक Pancreata संस्कृति या बरकरार पृथक आइलेट संस्कृतियों का इस्तेमाल किया विशेष उपचार की स्थिति में 10 के जवाब में [3 एच] thymidine निगमन, BrdU एल्डिहाइड-thionine या इंसुलिन दाग आबादी के भीतर समावेश या mitotic शव को मापने के लिए 11। ये इन विट्रो दृष्टिकोण और करीबी विविधताओं उसके कई सीमाएं हैं। प्रमुख तत्वों की कमी (1) भ्रूण कोशिकाओं जो, परिपक्व β-कोशिकाओं के विपरीत, एक उच्च बेसल β-सेल प्रतिकृति दर प्रदर्शित करने और एक अलग तरीके से 12 में विनियमित विकास कर रहे हैं का उपयोग शामिल है; (2) β-सेल प्रतिकृति घटनाओं के प्रयोगकर्ता निर्भर अधिनिर्णय के व्यक्तिपरक प्रकृति; (3) श्रम और β-सेल प्रतिकृति घटनाओं के प्रयोगकर्ता निर्भर मतगणना के समय गहन प्रकृति प्रयोगात्मक throughput अवरूद्ध; (4) परमाणु समावेश / दाग़ / उपस्थिति का उपयोग भी प्रतिकृति की पहचान करने के लिएटीएस और एक गैर अतिव्यापी cytoplasmic दाग β-कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आसन्न गैर-β-सेल प्रतिकृति घटनाओं बीटा कोशिकाओं के misattribution की ओर जाता है।
अभी हाल ही में परिपक्व प्राथमिक β कोशिकाओं β-सेल प्रतिकृति 13-16 पर अधिक अभिव्यक्ति ट्रांस्जीन के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से जीन उत्पाद या यौगिक उपचार आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन अध्ययनों से यह भी प्रतिकृति घटनाओं, β-सेल पहचान और / या श्रम प्रधान कदम है कि throughput की सीमा है, जैसे, कोशिकाओं या बरकरार आइलेट के व्यक्तिगत स्लाइड अच्छी तरह से चढ़ाना के लिए cytoplasmic staining- या गैर विशिष्ट तरीके के व्यक्तिपरक गिनती पर भरोसा किया है आयल एम्बेडिंग और प्रसंस्करण के 17। विशेष रूप से, एक छवि के आधार पर मानव β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग पद्धति, इस के साथ साथ प्रस्तुत एक के समान, 18 प्रकाशित किया गया है; हालांकि, इस परख के सफल प्रयोग का प्रदर्शन नहीं किया गया है और प्राथमिक जांच के लिए मानव टापू के उपयोग के लिए मोटे तौर पर नहीं किया जा सकता FEAअसंभव।
प्रतिकृति को बढ़ावा देने पदार्थों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति β-सेल लाइनों के विकास प्रेरण का आकलन करने के लिए है। प्रारंभिक प्रयासों जैसे min6 कोशिकाओं या आईएनएस 832/13-कोशिकाओं का इस्तेमाल किया 14,19-21 तब्दील β सेल लाइनों। हालांकि, इन सेल लाइनों अनर्गल विकास का प्रदर्शन और अच्छी तरह से भेदभाव कर β-कोशिकाओं को 22 के लिए छोटे सादृश्य भालू। नतीजतन, विकास प्रेरण क्षमता, कम से कम अस्पष्ट प्रासंगिकता की और कभी कभी पुनरावृत्ति करना मुश्किल है। सेल लाइन आधारित स्क्रीनिंग के लिए एक बेहतर रणनीति कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन (डॉक्सीसाइक्लिन) के अभाव में गिरफ्तार विकास निर्भर SV40 टी प्रतिजन अभिव्यक्ति 23,24 कर रहे हैं "reversibly तब्दील" इस्तेमाल करता है। हालांकि, यह इन कोशिकाओं को एक "सामान्य" β-सेल की तरह डॉक्सीसाइक्लिन हटाने पर राज्य को वापस है कि क्या स्पष्ट नहीं है। दुर्भाग्य से, इन कोशिकाओं के उपयोग सामान्यीकृत विकास को बढ़ावा देने यौगिकों कि तत्काल उपयोगिता है प्रकट नहीं करते प्राप्त हुए है24। कुल मिलाकर, सेल लाइनों का उपयोग एक सेल प्रकार न्यूनतम सहज प्रतिकृति गतिविधि को प्रदर्शित करने के विकास के विनियमन का अध्ययन करने के लिए सीमित प्रयोज्यता हो सकता है।
Β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग के साथ साथ प्रस्तुत मंच जहां तक संभव हो, वंश-प्रतिबंधित विकास को बढ़ावा देने की गतिविधियों की पहचान सकें मिश्रित सेल प्रकार की रचना आइलेट सेल संस्कृतियों, बहु को विवो विकास नियमन में बनाए रखने के लिए परिपक्व प्राथमिक चूहे β-कोशिकाओं का इस्तेमाल -अच्छी तरह पूर्वाग्रह को खत्म करने और throughput की सुविधा के लिए throughput और स्वचालित विश्लेषण अधिकतम करने के लिए स्वरूपण। इस मंच के सफल प्रयोग कई यौगिकों कि β-सेल प्रतिकृति 25,26 को बढ़ावा देने की पहचान के लिए सक्षम है। इसके अतिरिक्त, परख संरचना गतिविधि संबंध के अध्ययन और रासायनिक एपिस्टासिस प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है β-सेल प्रतिकृति की आणविक विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। प्रस्तुत मंच सफलतापूर्वक के लिए अनुकूलित किया गया थाβ-सेल प्रतिकृति के आर lentiviral आरएनएआई आधारित जांच 25 रास्ते। परख की सीमाएं प्रतिबंधित scalability शामिल (प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग), बल्कि मानव आइलेट कोशिकाओं (हालांकि परख मानव आइलेट के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है), खर्च एंटीबॉडी आधारित इमेजिंग और प्राथमिक आइलेट उपयोग, उपयोग के साथ जुड़े से कृंतक का उपयोग बिखरे टापू (बाधित आइलेट आर्किटेक्चर) स्वचालित छवि अधिग्रहण और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण क्षमता के साथ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप की उपलब्धता पर निर्भरता की सुविधा के लिए की। हालांकि जीन उत्पादों या यौगिकों कि बगल में β-सेल पुनर्जनन को प्रोत्साहित पहचान के लिए एक सतही इन विवो स्क्रीनिंग कार्यप्रणाली आदर्श होगा, इस तरह के एक मंच अभी तक उपलब्ध नहीं है 27। नतीजतन, वर्णित मंच β-सेल प्रतिकृति की सबसे पहलुओं की जांच में रुचि शोधकर्ता के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आणविक मार्ग है कि β-सेल के विकास और उत्थान पर नियंत्रण के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक विधियों मधुमेह शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इस के साथ साथ, एक चूहे-आइलेट आधारित स्क्रीनिंग मंच की पहचान क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford’s Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).
Materials
| 250g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 mL | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 mL | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
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