Un alto contenido<em> In Vitro</em> Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación
Summary
retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.
Abstract
Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.
Introduction
Diabetes abarca un conjunto de trastornos que comparten el punto final de la homeostasis de la glucosa alterado común. Aunque los mecanismos patogénicos de los subtipos de diabetes son distintos, comparten la consecuencia de una disminución de la masa de células β, es decir, la pérdida de la capacidad de producción de insulina 1,2. Actualmente, las estrategias de tratamiento de la diabetes dependen de la administración crónica de insulina exógena, la estimulación farmacológica de la producción de insulina o mejora de la sensibilidad a la insulina, y rara vez, el trasplante de islotes pancreáticos o todo el páncreas 3,4. Lamentablemente, el éxito de estas estrategias es de corta duración y / o falla de recapitular suficientemente la función de producción de insulina endógena. A pesar de la utilidad de desarrollar un método para estimular la regeneración de las células β, no existe tal enfoque. En consecuencia, un importante objetivo de la investigación de la diabetes es el desarrollo de métodos para generar nuevas células ß o para ampliar la masa de células β endógena-5 </sup>. A pesar de que la regeneración de las células β a partir de fuentes renovables, como las células madre embrionarias está avanzando, las preocupaciones de seguridad y eficiencia hacen que la búsqueda de estrategias alternativas, incluyendo la expansión de las células beta maduras, una prioridad 6,7. Es importante destacar que la fuente predominante de nuevas células beta in vivo es preexistentes células beta en lugar de células progenitoras especializados 8,9. Aunque las células beta parecen tener la capacidad de replicación limitado, un pequeño aumento en la masa de células β (~ 30%) puede ser suficiente para restaurar la homeostasis de la glucosa en muchos diabéticos. Además, pt la estimulación farmacológica in situ de la masa de células β es una estrategia de tratamiento potencialmente barata y escalable. En este documento se presenta un método de cribado de alto contenido para identificar y caracterizar moléculas pequeñas que estimulan el crecimiento de las células β.
Una variedad de métodos experimentales in vitro se puede utilizar para identificar productos génicos y / o moléculas that Promover la replicación de las células β primaria. Los primeros esfuerzos para medir la inducción de la replicación de las células β utilizan cultura roedor páncreas fetal o cultivos aislados de los islotes intactos para medir [3 H] timidina, incorporación de BrdU o cuerpos mitóticas dentro de la aldehído-tionina o población manchado insulina en respuesta a las condiciones de tratamiento específicas 10, 11. Estos enfoques in vitro y las ligeras variaciones de los mismos tienen varias limitaciones. Deficiencias prominentes incluyen (1) el uso de células fetales que, a diferencia de las células ß maduros, muestran una alta tasa de replicación de células β basal y son el crecimiento regulado de una manera distinta 12; (2) la naturaleza subjetiva de la adjudicación experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β; (3) la mano de obra y la naturaleza intensiva tiempo de conteo experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β retarda rendimiento experimental; (4) el uso de la incorporación / mancha / apariencia nuclear para identificar la replicación inclusots y una mancha citoplasmática que no se superponen para identificar las células beta conduce a la atribución errónea de los eventos de replicación no de células β próximas a las células beta.
Más recientemente, las células beta primarias maduras se han utilizado para evaluar el impacto de los transgenes sobre-expresión, así como el tratamiento de productos de genes o compuesto sobre la replicación de las células β 13-16. Sin embargo, estos estudios también se han basado en el conteo subjetiva de los eventos de replicación, staining- citoplasmática o no específicos métodos para la identificación de células β y / o pasos de trabajo intensivo que limitan el rendimiento, por ejemplo, placas individuales deslizable pocillo de células o islotes intactos inclusión en parafina y procesamiento 17. En particular, una metodología de selección replicación de las células β humano basado en imágenes, similar a la presentada en el presente documento, se ha publicado 18; Sin embargo, el uso con éxito de este ensayo no se ha demostrado y el uso de islotes humanos para el cribado primario puede no ser ampliamente FEAsible.
Una estrategia alternativa para la identificación de sustancias que promueven la replicación es evaluar la inducción de crecimiento de líneas de células β. Los esfuerzos iniciales se utilizan transformadas beta líneas celulares tales como células o MIN6 INS 832/13-células 14,19-21. Sin embargo, estas líneas celulares demuestran un crecimiento incontrolado y se parecen poco a las células ß bien diferenciados 22. En consecuencia, la capacidad de crecimiento de la inducción es mínima, de relevancia claro ya veces difícil de recapitular. Una estrategia mejorada para la detección basada en la línea celular utiliza "reversible transformado" células que son el crecimiento detenido en ausencia de tetraciclina (doxiciclina) la expresión del antígeno SV40 T dependiente de 23,24. Sin embargo, no está claro si estas células vuelven a un estado de células β-como "normal" tras la eliminación de doxiciclina. Desafortunadamente, el uso de estas células ha producido compuestos que promueven el crecimiento generalizadas que no parecen tener utilidad inmediata24. En general, el uso de líneas celulares para estudiar la regulación del crecimiento de un tipo de célula que muestra la actividad de replicación espontánea mínimo puede tener una aplicabilidad limitada.
La replicación de plataforma de cribado de células β presentada en este documento utiliza células beta de rata primaria maduros para retener en la regulación del crecimiento in vivo en la medida posible, los cultivos de células de los islotes de la composición de tipo de células mixtas para permitir la identificación de las actividades promotoras del crecimiento de linaje restringido, multi -bien formato a maximizar el rendimiento y análisis automatizado para eliminar los prejuicios y facilitar el rendimiento. El uso exitoso de esta plataforma ha permitido la identificación de varios compuestos que promueven la replicación de las células β 25,26. Además, el ensayo se ha utilizado para los estudios de relación estructura-actividad y experimentos de epistasis químicos para proporcionar información mecanicistas sobre la regulación molecular de la replicación de las células β. La plataforma presentada fue adaptado con éxito foinvestigación basada en RNAi r lentiviral de replicación de las células β vías 25. Limitaciones de la de ensayo incluyen escalabilidad restringida (uso de células primarias), el uso de roedores en lugar de los islotes células humanos (aunque el ensayo puede ser adaptado para estudios de los islotes humanos), los gastos asociados con la formación de imágenes basada en anticuerpos y la utilización de los islotes primaria, el uso de islotes dispersos (arquitectura islote interrumpido) para facilitar la adquisición de imágenes automatizado y la dependencia de la disponibilidad de un microscopio automatizado con adquisición de la imagen y la capacidad de análisis. Aunque un fácil pt metodología de selección in vivo para la identificación de productos génicos o compuestos que estimulan la regeneración de las células β in situ sería ideal, una plataforma de este tipo todavía no está disponible 27. En consecuencia, la plataforma se ha descrito es apropiado para el investigador interesado en la investigación de la mayoría de los aspectos de la replicación de las células β.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos experimentales para el estudio de las vías moleculares que controlan el crecimiento de las células β y la regeneración son herramientas importantes para investigadores de la diabetes. En este documento, una plataforma de cribado basado en la rata de los islotes para identificar y caracterizar los estimuladores de molécula pequeña de la replicación de las células β se presenta.
Aunque la mayoría de los aspectos de este protocolo son fácilmente realizadas por los invest…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford’s Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).
Materials
| 250g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 mL | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 mL | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
Referências
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