Konventionella metoder för att initiera suspension aggregat baserade hjärt differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) plågas med odlings heterogenitet med avseende på aggregatstorlek och form. Här beskriver vi en robust metod för hjärtdifferentiering som utnyttjar mikro att generera storlek styrda hPSC aggregat odlas under hjärtfrämjande förhållanden.
Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.
I cell vitro-odling kan utföras under ett antal villkor, men genomföres typiskt antingen i tvådimensionella vidhäftande förhållanden eller i tredimensionella upphängnings villkor som mer fullständigt rekapitulera in vivo system. Följaktligen finns det en växande trend i många forskningsområden att utveckla robusta metoder för att generera tredimensionella vävnadskonstruktioner. I scenarier där typer och processer cell kräver en stödjande extracellulärt matrix (ECM) yta och vidhäftnings signaler kan tredimensionella kultur aktiveras via bygga ställning konstruktioner, där celler odlas på eller i en exogen bärarmatris en. Celler och processer som inte kräver vidhäftning till en stödjande matris kan utföras i suspension som unscaffolded system består huvudsakligen eller uteslutande av celler (som sedan kan fortsätta att skapa sina egna endogena matriser) 2,3. Här presenterar vi ett protokoll för hjärtdifferentiering of humana pluripotenta stamceller (hPSCs – stamceller kan bli någon celltyp i kroppen, vare sig från embryon eller andra källor) i storlekskontrollerade, enhetlig, unscaffolded aggregat.
Differentieringen av hPSCs som upphängningsaggregat plågas av stora variationer i den aggregerade storlek både inom en körning och mellan körningar. Denna variation är en konsekvens av den metod som typiskt används för att generera dessa aggregat, som innebär mekanisk dissociation av cellkolonier. För att minska denna variation, har ett antal tillvägagångssätt använts för att kontrollera antalet celler per aggregat samt aggregatdiametern och enhetlighet. Som exempel kan nämnas bildning av aggregat i mikrocentrifugrör 4 eller som hängande droppar fem definierade micropatterning tvådimensionella hPSC kolonier 6 som sedan kan överföras till avstängning eller centrifugering av celler i U- eller V-botten flerbrunnsplattor 7,8, 9. Men alla dessa ca.oaches begränsas av deras låga genomströmningen av den samlade generation. Väl-baserade system använder en liknande strategi för V-bottenplatta system, men den mindre storleken av de mikro (i detta protokoll var och en har en bredd av 400 pm) möjliggör generering av ett större antal likformiga aggregat från en enda kultur-plattbrunn (standarddiameter av ~ 15,5 mm innehållande ~ 1.200 mikrobrunnar) än vad som skulle genereras från en hel V-bottenplatta 10. Väl baserade aggregatbildning har använts i ett antal inställningar inklusive differentiering av hPSCs att ektodermal 11, endodermalt 12, mesodermala 13 och extraembryonic 14 öden; kondrogenes från mesenkymala stamceller 15; generering av enhetliga substrat för toxikologisk screening 16; och undersökningar av mechanobiology 17.
En stor utmaning i att utveckla robusta tillverkningsprotokoll för framställning av hPSC härrörande cardiomyocytes har varit bristen på reproducerbarhet i hjärt differentiering effektivitet mellan körningarna. Vi visade tidigare att denna variation kan hänföras till heterogenitet i start hPSC befolkningen, som omfattar både självförnyande hPSCs och differentierande celler som uttrycker gener associerade med endoderm och neural differentiering 6,18. Signaler utsöndrade av dessa differentierande cellerna påverka hjärt induktion. Specifikt främjar extraembryonic endoderm hjärt induktion, medan neurala stamceller hämmar hjärt induktion. Upon hPSC aggregering, celler inom aggregatet differentiate och organisera så att odifferentierade hPSCs är omgivna av ett skikt av extraembryonic endoderm celler som utvecklas på den sammanlagda ytan 13. Genom att kontrollera aggregatstorlek, kan vi modulera förhållandet av hjärt-inducerande endoderm celler till odifferentierade hPSCs (ytarea till volymkvot) och optimera detta förhållande för maximal hjärt induktion 13.
Det har observerats att en effektiv hjärt differentiering av pluripotenta stamceller är en mycket varierande process. Även om det är inte förvånande att olika cellinjer uppvisar olika benägenheter för differentiering förmåga att specifika celltyper, har det visat sig att hjärt differentiering effektivitet varierar dramatiskt mellan kopia körs använder samma cellinje 6. Protokollet som beskrivs här tar upp en stor källa till denna variabilitet genom att direkt styra den ingående cellantalet per aggregat. För att ytterligare minska variationen mellan körningarna, rekommenderas att hPSC linjer anpassade för enskild cell passage används, eftersom denna form av hPSC utbyggnad och underhåll resulterar i mer konsekventa pluripotenta populationer med avseende på expressionsfrekvenser av pluripotens markörer (t.ex. Oct4, NANOG, Tra-1-60, etc.).
Protokollet som skrivits här anger en sammanlagd storlek av 1000 celler för optimal hjärt induktion från HES-2 embryonal stamcellslinje. Att tillämpa detta protokoll för olika cellinjer, är det viktigt att en initial sammanlagd storlek skärmen för att bestämma cellinje specifika optimala aggregatstorlek. Även om det inte direkt påverkar de förfaranden som skall följas här, vi påminna läsaren om att förändringar i aggregatstorlek och totala celltätheten förväntas påverka syretillförsel. Detta kan bli en relevant fråga i tillämpningar nedströms. Dessutom är apoptotisk celldöd ett bekymmer under dissociation av hPSCs till enskilda celler. Därför är det viktigt att se till att ROCK-inhibitor är närvarande under tvångs cellaggregation i mikrobrunnarna. Slutligen är det kritiskt att på dag 4 av differentiering aggregaten är väl tvättas för att avlägsna spår Aktivin A, närvarande i den Induktion 1 Medium, före återsuspension i Induktion 2 Medium. Efter dag 4 av differentiering, främjar Aktivin A endoderm differentiering på bekostnad av mesoderm induktion 20.
Den viktigaste tillämpningen av denna teknik är att fyllnadsmassor storlekar som främjar en effektiv hjärtdifferentiering. Men är en av begränsningarna i den aktuella tekniken att det är svårt att skala hjärt produktionen till kliniskt relevanta nivåer med mikroplattor. Skala upp av hjärt differentiering utförs typiskt i bulk odlingsbetingelser i omrörd suspension bioreaktorer 21. Därför, när mikrosystemet har använts för att bestämma acceptabla intervall av aggregatstorlek för effektiv hjärt induktion, är nästa steg att skala upp för att bestämma bioreaktor propellerhastigheter som kan generera den önskade cellaggregatstorlek.
En av de stora skillnaderna i denna teknik med avseende på andra metoder för aggregat baserade hjärt differentiering är att det möjliggör direkta undersökningar modulera effekterna av endogena signalering i aggregat samtco-kultur av induktiva / hämmande vävnadstyper med hPSCs i aggregatet 13. Dessa typer av undersökningar kan informera processutveckling av storskalig hjärt produktion.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.
Biological safety cabinet | |||
Pipette aid | |||
Serological pipettes (5 to 25 mL) | |||
Aspirator | |||
Aspirator or Pasteur pipettes | |||
15 and 50 mL conical tubes | |||
Fume hood | |||
0.22 µm syringe filter | |||
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
Bench-top microcentrifuge | |||
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Vortex | |||
Ice | |||
-20C freezer | |||
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
Transferrin | Roche | 10652202001 | |
BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
100X Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
100X L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
Hemocytometer | |||
Trypan Blue | |||
Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
96 well plate (for FACS staining) | |||
Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
5 mL round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |