में इमेजिंग कैल्शियम<em> ड्रोसोफिला</em> अंडा एक्टिवेशन पर

Summary

यह लेख ड्रोसोफिला में अंडा सक्रियण के दौरान ^{2 +} सीए visualizing के लिए एक अनुकूलनीय पूर्व vivo प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca²⁺) often termed a ‘Ca²⁺ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca²⁺ wave varies between species, the change in intracellular Ca²⁺ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.

In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca²⁺-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca²⁺ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca²⁺ wave and the downstream changes associated with it.

Introduction

अंडे (oocyte) सक्रियण पर intracellular सीए में बदलाव ^{2 +} एकाग्रता सभी का अध्ययन जीवों ^1,2 के एक संरक्षित घटक है। इस घटना को सीए ² निर्भर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज, कोशिका चक्र की बहाली और संग्रहीत mRNAs का अनुवाद सहित शुरू की। सीए ² के लिए इस आवश्यकता, intracellular सीए ² सांद्रता में क्षणिक परिवर्तन visualizing के कारण प्रमुख ब्याज की गई है।

ऐतिहासिक दृष्टि से, मॉडल जीवों अंडा सक्रियण पर अध्ययन आकार और उनके अंडे की उपलब्धता के आधार पर चयन किया गया था। विभिन्न दृश्य दृष्टिकोण का पालन करें और इन प्रणालियों में ^{2 +} सांद्रता, सहित intracellular सीए में बदलाव यों के लिए उपयोग किया गया है: medaka मछली ³ में photoprotein aequorin; ऐसे Fura-2 के समुद्री साही और हम्सटर ^4,5 के रूप में सीए ² संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों; और कैल्शियम हरी-1-dextran Xenopus ⁶ में।

पीढ़ी और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIS) में सुधार की विवो ⁷ में सीए ² गतिशीलता कल्पना करने की क्षमता तब्दील हो गया है। ये आनुवंशिक निर्माणों विशिष्ट ऊतकों में व्यक्त किया और आक्रामक ऊतक की तैयारी ⁸ के लिए जरूरत की सीमा रहे हैं।

GCaMPs उनके उच्च सीए ² आत्मीयता के कारण एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) GECIS है कि बहुत प्रभावी किया गया है की आधारित वर्ग के हैं, संकेत करने वाली शोर अनुपात और क्षमता ^9-11 अनुकूलित किया जाना है। सीए ² की उपस्थिति में, GCaMP जटिल गठनात्मक परिवर्तन की एक श्रृंखला आए, calmodulin करने के लिए सीए ² के बंधन के साथ शुरू, कि GFP घटक ⁹ का एक बढ़ा फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिणाम है।

GCaMPs बड़े पैमाने पर intracellular कैल्शियम ¹² में परिवर्तन कल्पना करने के लिए ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स पर अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में आवेदनGCaMP प्रौद्योगिकी परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे में ^{2 +} सीए कल्पना करने की पर एक भी क्षणिक सीए ² अंडे सक्रियण ^13,14 पर लहर पता चला है। सीए ² लहर विवो ¹³ में ovulation के दौरान या उच्च बढ़ाई एक पूर्व vivo सक्रियण परख ^13,14 का उपयोग कर कम बढ़ाई देखे जा सकते हैं। पूर्व vivo परख में, अलग-अलग परिपक्व oocytes अंडाशय से अलग है और एक hypotonic समाधान का उपयोग कर सक्रिय कर रहे हैं, सक्रियण बफर, जो इन विवो सक्रियण ^15-17 की घटनाओं की पुनरावृत्ति को दिखाया गया है के रूप में भेजा।

इस पूर्व vivo परख औषधीय व्यवधान, शारीरिक जोड़तोड़ और आनुवंशिक म्यूटेंट सहित विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत सीए ² लहर के आसान उच्च संकल्प दृश्य सक्षम बनाता है। यह लेख पूर्व vivo सक्रियण और वीं के लिए परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे की तैयारी दर्शाता हैई बाद GCaMP का उपयोग करते हुए सीए ² लहर कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी। यह दृष्टिकोण दीक्षा और सीए ² लहर के नियंत्रण परीक्षण करने के लिए और नीचे की ओर परिणामों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नोट: कमरे के तापमान पर सभी कदम बाहर ले जब तक अन्यथा कहा। 1. विच्छेदन के लिए तैयार कर रहा है नोट: कदम यहाँ वर्णित ई Gavis, प्रिंसटन विश्वविद्यालय और वेल एट के अनुसार हैं। अल। 18। इमेजिंग से पहले निम्न चरणों के दो दिनों के प्रदर्शन करना। ठोस आहार की लगभग 10 मिलीग्राम से युक्त एक मक्खी शीशी ले लो और एक कोने में सूखे खमीर की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं, कम से कम 1 ग्राम के लिए पर्याप्त है। नोट: मक्खी शीशियों या भोजन के बारे में जानकारी देखना 'ड्रोसोफिला रखरखाव' 19। पानी के 3 बूँदें खमीर हाइड्रेट करने के लिए – 1 जोड़ें। शीशी एक 45 डिग्री के कोण पर अलग सेट और अनुमति 3 – पानी लेने के लिए खमीर के लिए 5 मिनट। खमीर पानी को अवशोषित है, वहीं UASt- MYR GCaMP5 20 टब-VP16GAL4 द्वारा संचालित व्यक्त मक्खियों की एक बोतल एक myristoy का चयन करें (GCaMP5 के रूप में) है कि हाल ही में उभरा है (GCaMP5 की lated रूप में अंडा झिल्ली को GECI tethering) के माध्यम से शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत प्रदान करने के लिए चुना गया था। साथ सीओ 2 गैस की बोतल में मक्खियों बेहोश करना। उल्टे इतनी के रूप में गीला भोजन में मक्खियों नहीं कम करने की बोतल रखना सुनिश्चित करें। सीओ 2 पैड पर anesthetized मक्खियों युक्ति और तरह 10 – 15 महिलाओं और 5 पुरुषों एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक तूलिका का उपयोग कर। नोट: यह विच्छेदन के लिए स्वस्थ महिलाओं प्रदान करने के लिए पुरुषों को शामिल करने के लिए मानक है। जब कदम 1.3 से शीशी के लिए तैयार है, शीशी के लिए चयनित मक्खियों जोड़ें। शीशी क्षैतिज रखने के लिए जब तक मक्खियों सक्रिय हो जाते हैं ख्याल रखना। 25 डिग्री सेल्सियस पर शीशी लगभग 36 घंटे के लिए रखें। बोतल या त्यागने के लिए सीओ 2 पैड से शेष मक्खियों लौटें। 2. विदारक ड्रोसोफिला अंडाशय नोट: कदम यहाँ वर्णित वेल एट के अनुसार हैं। अल। <s> 18 अप। 36 घंटे के बाद, सीओ 2 के साथ yeasted शीशी से मक्खियों चतनाशून्य। एक बार जब शीशी के अंदर मक्खियों anesthetized हैं उन्हें सीओ 2 पैड पर टिप एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक पेंट ब्रश के साथ हल किया जाना। एक महिला का चयन करें। महिला से दो अंडाशय अलग। पूर्ण विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए वेल एट देखें। अल। 18। संक्षेप में: ऑक्सीजन हेलोकर्बन तेल (श्रृंखला 95) की एक छोटी सी बूंद एक नहीं, 1.5, 22 x 40 मिमी coverslip पर रखें। पेट के पूर्वकाल में संदंश के साथ महिला समझ। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत महिला होल्डिंग, संदंश के दूसरे सेट का उपयोग धीरे महिला के पीछे हटाने के लिए। दूसरी संदंश से पीछे ऊतक से साफ कर लें। पेट के पीछे पूर्वकाल से दूसरे संदंश के साथ पेट गुहा पर निचोड़। दो अपारदर्शी अंडाशय जब फेमा के बाहर संदंश के लिए रहना चाहिएle। तेल में अंडाशय स्पर्श करें। संदंश बंद पोंछते द्वारा संदंश से किसी भी ऊतक निकालें। एक मक्खी से तीन coverslips प्राप्त करने के लिए प्रत्येक युक्त अंडाशय, – इन चरणों (2.4.7 2.4.1) दोहराएँ। 3. अलग-अलग परिपक्व अंडे बढ़ाई 2.4 कदम से, 4X करने के लिए सेट पहले coverslip पर के साथ एक मानक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, डिंबवाहिनी फाड़ दो अंडाशय अलग। ख्याल रख रही किसी भी अंडा कक्षों पंचर करने के लिए नहीं, एक भी अंडाशय के केंद्र में बंद संदंश की एक जोड़ी का परिचय। बंद संदंश के बगल में अंडाशय के केंद्र में एक मानक विदारक जांच डालें। धीरे पीछे ध्रुव, जहां परिपक्व अंडे (अंडे चरण 14 कक्षों) स्थित हैं की दिशा में अंडाशय के माध्यम से विदारक जांच खींचें। दोहराएँ कदम 3.1 – अंडाशय और अंडे की संख्या के आकार पर निर्भर 5 बार – 3.4 2। नोट: सीओ 2 के अलावा </उप> आम तौर पर एक अंडा जो अधिक से पूर्व जमा अंडे उठाया पृष्ठीय उपांग के साथ बड़ा दिखाई देगा का जमाव का कारण बनता है। इस अंडे इमेजिंग के लिए खारिज किया जाना चाहिए, क्योंकि यह पहले से ही महिला के अंदर सक्रिय हो गया है। नोट: परिपक्व अंडे डिम्बग्रंथि संयोजी ऊतक से आसानी से अलग करने के लिए की संभावना है। कोई परिपक्व अंडे अंडाशय के बाहर दिखाई दे रहे हैं, तो विदारक जांच के साथ चिढ़ा धीरे जारी है। coverslip के केंद्र में एक पंक्ति में 5 – एक बार परिपक्व अंडे अंडाशय के बाहर coverslip पर दिखाई दे रहे हैं, 3 छल। नोट: सबसे अच्छा परिणाम के लिए, अंडे के पक्ष के साथ धीरे जांच चलाते हैं। नोट: पृष्ठीय उपांग पर खींच के रूप में इस अंडे को नुकसान पहुंचा सकता से बचें। नोट: भविष्य इमेजिंग सेट-अप पर निर्भर करता है, अधिकतम इमेजिंग क्षेत्र के लिए coverslip सीधा करने के लिए लगभग 200 माइक्रोन के अलावा अंडे संरेखित। एक बार जब गठबंधन, गठबंधन अंडे से दूर खींच च का उपयोग करके डिम्बग्रंथि ऊतक के बाकी को दूरorceps। एक चिकित्सा पोंछ के कोने के साथ dabbing द्वारा अतिरिक्त तेल निकालें। परिपक्व अंडे को छूने के लिए सावधान नहीं किया जा चिकित्सा पोंछ के रूप में परिपक्व अंडे संपर्क कर रहे हैं कि खो जाएगा साथ। एक मार्कर के साथ coverslip पर एक crosshair ड्रा खुर्दबीन के नीचे नमूना लगाने को आसान बनाने के लिए। एक सुरक्षित जगह में coverslip सेट और 5 के लिए आराम करने के लिए coverslip पर तैयार अंडा कक्षों छोड़ – 10 मिनट। इस अंडे तेल में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है। नमूने 1 घंटा के बाद विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दोहराएँ 3.1 कदम – 3.11 उन पर अंडाशय के साथ coverslips के आराम के लिए। 4. इमेजिंग के लिए तैयारी कमरे के तापमान के लिए तैयार सक्रियण बफर 15 लाओ। नोट: सक्रियण बफर एक hypotonic बफर है: 3.3 मिमी नः 2 4 पीओ, 16.6 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 10 मिमी NaCl, 50 मिमी KCl, 5% पॉलीथीन ग्लाइकोल 8000, 2 मिमी CaCl 2, एक 1 के साथ पीएच 6.4 के लिए लाया: NaOH के 5 अनुपात: KOH।अधिक जानकारी के लिए Mahowald, 1983 को देखने के लिए 15। सक्रियण बफर के Aliquots 2 सप्ताह के लिए महीने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। ध्यान से इमेजिंग सुविधा के लिए तैयार coverslips, सक्रियण बफर और कांच pipettes परिवहन। नोट: एक व्यापक क्षेत्र, confocal, कताई डिस्क या प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है। हम एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना चाहिये। हमारे प्रतिनिधि परिणाम एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे। पूरे परिपक्व अंडे इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक उद्देश्य (यहाँ: 20X 0.7 एनए) चुना जाना चाहिए। माइक्रोस्कोप मंच पर पहले से तैयार coverslip माउंट। देखभाल के मंच पर coverslips तोड़ने के लिए नहीं ले लो। गुणात्मक क्रियान्वयन के लिए एक परिपक्व अंडे चैम्बर के साथ देखने का एक क्षेत्र का चयन करें। छवि की हवा निकाल दी अंडा कक्षों या झिल्ली में blebbing के साथ उन लोगों को नहीं है। नोट: कदम 4.6 – 4.7, सॉफ्टवेयर आदेशों माइक्रोस्कोप और निर्माता के आधार पर अलग अलग होंगे। सेट इमेजिंग पैरा(- 580 एनएम 500) मानक GFP उत्तेजना (488 एनएम) और उत्सर्जन के लिए मीटर है। इसके अलावा आदेश कल्पना और परिपक्व अंडे और विस्थापित तेल बोध कराता है में एक उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य की स्थापना की। सबसे कम Z विमान जहां परिपक्व अंडे दिखाई दे रहे हैं का चयन करें और एक पूर्ण जेड ढेर सेट कदम प्रति 40 माइक्रोन से लगभग 2 माइक्रोन के लिए ले जाया जाएगा। मानकों सेट तो वहाँ Z ढेर अधिग्रहण के बीच कोई देरी नहीं है। लगभग 30 मिनट के लिए कब्जा करने के लिए समय की श्रृंखला सेट करें। 5. इमेजिंग पूर्व विवो अंडे एक्टिवेशन छवि पर कब्जा करना शुरू करें। 2 पूर्ण जेड ढेर अधिग्रहण किया जाना है – 1 के लिए प्रतीक्षा करें। इस सक्रियण से पहले परिपक्व अंडे से पता चलता है। एक गिलास पिपेट में सक्रियण बफर के लगभग 300 μl वापस ले लें। गिलास coverslip के ऊपर एक 45 डिग्री के कोण पर सक्रियण बफर युक्त पिपेट की नोक पोजिशनिंग, धीरे धीरे किरण पथ में पिपेट कदम जब तक यह सीधे ऊपर परिपक्व अंडे imaged किया जा रहा है। कांच पिपेट चाहिएतेल के ऊपर 2 सेमी – 1 हो। कांच पिपेट से कम से कम 5 सेकंड में सक्रियण बफर के 2 बूँदें – 1 जोड़ें। इस तेल विस्थापित होना चाहिए। अतिरिक्त सक्रियण बफर जोड़ने या कांच विंदुक के साथ अंडे को छूने के रूप में यह परिपक्व अंडे के विस्थापन का कारण बन सकता से बचें। देखभाल के रूप में इस उद्देश्य को और coverslip के बीच विसर्जन के तेल में फार्म फोकल हवाई जहाज़ या हवाई बुलबुले में एक परिवर्तन का कारण बन सकता पिपेट साथ coverslip को छूने के लिए नहीं ले लो। छवि अधिग्रहण के दौरान सक्रियण बफर जोड़ने नदीम, उज्ज्वल क्षेत्र चैनल की जांच सुनिश्चित करने के लिए कि तेल सक्रियण बफर से विस्थापित कर दिया गया है। नोट: यह पहली पिपेट किरण पथ को तोड़ने के कारण एक छाया के रूप में दिखाई देते हैं, लेकिन यह भी छोटे तेल की बूंदों की उपस्थिति में परिणाम होगा। कुछ तेल बूंदों परिपक्व अंडे प्रयोगात्मक परिणामों और छवि गुणवत्ता को प्रभावित करेगा जिसके साथ जुड़े रह सकते हैं। तेल सक्रियण बफर दोहराने की प्रारंभिक अलावा से विस्थापित नहीं किया जाता है तो कदम 5.4 – 5.6। एक बार जब तेल सफलतापूर्वक विस्थापित है, समय श्रृंखला पूरा होने तक चलाने के लिए अनुमति देते हैं। नोट: कारण सक्रियण पर oocytes की सूजन, कुछ अंडे कक्षों नाटकीय रूप से फोकल हवाई जहाज़ या देखने के क्षेत्र से बाहर सक्रियण बफर के अलावा पर कदम होगा। इस स्थिति में, अधिग्रहण रोकने के लिए और अगले coverslip माउंट। छवि अनुक्रम अधिग्रहण पूरा कर लिया है के बाद, डेटा को बचाने के। 6. अधिग्रहण के बाद इमेज प्रोसेसिंग फिजी (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), या समकक्ष इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा सेट खोलें, और विश्लेषण के लिए संबंधित फाइल का चयन करें। प्राप्त डेटा के एक प्रक्षेपण का निर्माण करने के लिए चयन: छवि> ढेर> जेड परियोजना। एक शुरुआत के जेड-टुकड़ा और एक बंद जेड टुकड़ा, आम तौर पर पूरे खंड का चयन करें। एक प्रक्षेपण प्रकार, आम तौर पर 'मैक्स तीव्रता' करने के लिए सेट का चयन करें। पूरी श्रृंखला के लिए चयनित सेटिंग्स को लागू करने के लिए टिक बॉक्स 'सभी समय फ्रेम' की जाँच करें। अगरएक से अधिक फ्लोरोसेंट चैनल imaged किया गया है, रंगों के बीच आंदोलन को सक्षम करने के लिए चैनल उपकरण का उपयोग कर एक समग्र, या छवि स्केल बनाते हैं। चुनें छवि> रंग> चैनल उपकरण। छवि चमक को समायोजित करने और चुनिंदा छवि के विपरीत करने के लिए> समायोजित> चमक / विपरीत। एक छवि का निर्यात करने के लिए, प्रासंगिक फ्रेम और फ़ाइल> इस रूप में सहेजें> जेपीईजी, या किसी भी पसंदीदा प्रारूप करने के लिए timescale स्लाइडर ले जाएँ। निर्यात फ़ाइल के लिए स्थान और शीर्षक चुनें, तो बचा लो। नोट इमेजिंग सॉफ्टवेयर से फ्रेम दर छवि पर एक समय टिकट देने के लिए आवश्यक हो जाएगा। एक फिल्म के रूप में समय की श्रृंखला निर्यात करने के लिए चयन करें: फ़ाइल> इस रूप में सहेजें> AVI, तो फ्रेम दर (~ प्रति सेकंड 7 फ्रेम) का चयन करें। निर्यात फ़ाइल के लिए स्थान और शीर्षक चुनें, तो बचा लो। फिजी प्रारूप में समायोजित फाइल को बचाने के लिए, फ़ाइल> सहेजें।

Representative Results

यहाँ हम कैसे पूर्व vivo सक्रियण के लिए परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे तैयार करने के लिए प्रदर्शन किया है। अंडे अंडे सक्रियण पर 2 + गतिशीलता सीए की एक GECI इमेजिंग सक्षम और भ्रूण के विकास की शुरुआत (चित्रा 1) व्यक्त। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि GCaMP के आधार पर इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से एक myristoyl समूह की उपस्थिति, परिणाम मामूली गुणात्मक मतभेद 13 14 हो सकती है। हम यह भी actin polymerization के एक अवरोध के अलावा द्वारा अंडे सक्रियण के दौरान कार्यात्मक actin के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन किया है, cytochalasin डी, सक्रियण बफर (चित्रा 2) 14। अंडा सक्रियण पर cytoskeleton के लिए एक आवश्यकता संरक्षित है। सी में एलिगेंस, निषेचन के बाद, cytoskeletal घटकों पहली विषम विभाजन 21,22 के लिए एक सेल भ्रूण तैयार करने के लिए पुनर्गठित कर रहे हैं। समुद्री साही में, cytoskele के विघटनताल पुनर्गठन सक्रियण निम्नलिखित सिकुड़ा अंगूठी गठन 23 को रोकने के द्वारा सेल चक्र को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। एक सीए 2 लहर और ड्रोसोफिला में अंडा सक्रियण पर अपने बहाव समारोह में मध्यस्थता में actin की भूमिका पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना है। ड्रोसोफिला में, सीए 2 लहर और actin cytoskeleton के सह दृश्य इस पूर्व vivo सक्रियण परख का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। कई चैनलों के समय श्रृंखला का अधिग्रहण किया जा सकता है और intracellular सीए 2 की गतिशीलता oocyte (चित्रा 3) में actin संगठन में परिवर्तन के साथ मिलान किया जा सकता है। चित्रा 1:। पूर्व vivo की ड्रोसोफिला अंडे सक्रियण समय श्रृंखला में एक ही सीए 2 वेव ड्रोसोफिला अंडे एक के बाद UASt- myrGCaMP5 व्यक्त परिपक्वसक्रियण बफर (एएच) की ddition। Cytoplasmic सीए में वृद्धि 2 + पीछे ध्रुव (बी) और propagates (बीएफ) लगभग 1.5 माइक्रोन / सेकंड की औसत वेग के साथ कम से निकलती है। लहर की शुरूआत आमतौर पर सक्रियण बफर के अलावा के 3 मिनट के भीतर मनाया जाता है। सक्रियण के बाद, परिपक्व अंडे के intracellular कैल्शियम का स्तर पूर्व सक्रियण स्तर (जी, एच) के लिए आए। पूरक मूवी 1 (कुल समय 33 मिनट) देखें। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2: सक्रियण बफर Perturbs सीए को cytochalasin डी के अलावा2 + वेव प्रचार। पूर्व vivo के समय श्रृंखला ड्रोसोफिला अंडे निम्नलिखित सक्रियण 10 माइक्रोग्राम / एमएल cytochalasin डी अंतिम एकाग्रता (एएच) युक्त बफर के अलावा UASt- myrGCaMP5 व्यक्त परिपक्व। नदीम सीए 2 लहर पीछे ध्रुव (ए) में शुरू की है, यह समझौता किया है और अंडे (एफ) के पूर्वकाल तक पहुँच नहीं है (सफेद तीर लहर के सामने निरूपित)। आगे कोई सीए 2 परिवर्तन 30 मिनट से अधिक मनाया गया)। पूरक मूवी 2 (कुल समय 30 मिनट) देखें। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3: ई पर actin और सीए 2 के सह-दृश्यपूर्व vivo की ड्रोसोफिला। समय श्रृंखला में जी जी एक्टिवेशन ड्रोसोफिला अंडे UASt- myrGCaMP5 (सियान) और UASp एफ-Tractin.tdTomato (मैजंटा) सक्रियण बफर के निम्नलिखित अलावा (एएच) व्यक्त परिपक्व। सीए 2 लहर पीछे ध्रुव से शुरू की और चित्रा के रूप में ठीक हो जाए 1। Actin, सफेद तीर (ए बनाम एच) समय के साथ बदल रहा प्रतीत होता है। परिपक्व अंडे के केंद्र में सीए 2 संकेत का पता लगाने की कमी छवि पर कब्जा दौरान नमूना के आंदोलन की वजह से है। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.

Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca²⁺ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.

Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.

This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited ¹³, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.

There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca²⁺ wave in mutant backgrounds ^14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca²⁺ wave.

Materials

Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
		Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80mm x 25mm