Imaging Kalsium i<em> Drosophila</em> På Egg Activation

Summary

Denne artikkelen beskriver en tilpasningsdyktig ex vivo-protokollen for å visualisere Ca ²⁺ i løpet egg aktivering i Drosophila.

Abstract

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca²⁺) often termed a ‘Ca²⁺ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca²⁺ wave varies between species, the change in intracellular Ca²⁺ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.

In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca²⁺-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca²⁺ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca²⁺ wave and the downstream changes associated with it.

Introduction

En endring i intracellulær Ca ²⁺ konsentrasjon på egg (eggcelle) aktivering er en fredet del av alle undersøkte organismer ^1,2. Dette arrangementet initierer et bredt spekter av Ca2 ⁺ -avhengige prosesser, herunder gjenopptakelse av cellesyklusen og translasjon av mRNA som er lagret. På grunn av dette kravet for Ca ^2+, visualisere forbigående endringer i intracellulære Ca ²⁺ konsentrasjon har vært av avgjørende interesse.

Historisk sett ble modellorganismer valgt for studier av egg aktivisering basert på størrelsen og tilgjengeligheten av eggene sine. Forskjellige visualiserings tilnærminger har blitt benyttet for å følge og kvantifisere endringer i intracellulær Ca2 ⁺ konsentrasjoner i disse systemer, herunder: den photoprotein aequorin i medaka fisk ^3; Ca ²⁺ sensitive fluorescerende fargestoffer som Fura-2 i kråkeboller og hamster ^4,5; og kalsium green-en-dekstran i Xenopus ^6.

Den generasjonen og forbedring av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) har forvandlet evne til å visualisere Ca ²⁺ dynamikk in vivo ^7. Disse genkonstruksjoner er uttrykt i spesifikke vev og minimalisere behovet for invasive vevspreparater ^8.

GCaMPs er et grønt fluorescerende protein (GFP) -basert klasse av GECIs som har vært meget effektiv på grunn av deres høye affinitet Ca2 ^+, signal-til-støyforhold og evne til å tilpasses ^9-11. I nærvær av Ca ^2+, gjennomgår GCaMP komplekset en serie av konformasjonsendringer, som starter med bindingen av Ca ²⁺ til kalmodulin, som resulterer i en øket fluorescerende intensitet av GFP-komponenten ^9.

GCaMPs har vært mye brukt i forskning på Drosophila nevroner å visualisere endringer i intracellulær kalsium ^12. De siste applicatipå av GCaMP teknologi for å visualisere Ca ²⁺ i modne Drosophila egg har avdekket en eneste forbigående Ca ²⁺ bølge på egg aktivisering ^13,14. Ca ²⁺ bølge kan visualiseres ved lav forstørrelse under eggløsningen in vivo ¹³ eller ved høyere forstørrelse ved hjelp av en ex vivo aktiveringstest ^13,14. I ex vivo-forsøk, blir de enkelte modne oocytter isolert fra ovariene og aktivert ved hjelp av en hypoton løsning, betegnet som aktiveringsbuffer, som har vist seg å rekapitulere hendelsene i in vivo aktivering ^15-17.

Denne ex vivo-analyse gjør det enkelt høyoppløselig visualisering av Ca ²⁺ bølgen ved ulike eksperimentelle forhold, inkludert farmakologiske avbrudd, fysiske manipulasjoner og genetiske mutanter. Denne artikkelen viser fremstilling av modne Drosophila egg for ex vivo aktivering og the påfølgende mikroskopi brukes til å visualisere Ca ²⁺ bølge hjelp GCaMP. Denne tilnærmingen kan brukes for å teste initiering og kontroll av Ca ^{2 +} bølge og å probe nedstrøms resultater.

Protocol

Merk: Utfør alle trinn ved romtemperatur hvis ikke annet er oppgitt. 1. Forberedelse til Dissection Merk: Trinnene er beskrevet her er i samsvar med E. Gavis, Princeton University og Weil et. al. 18. Utfør følgende trinn to dager før bildebehandling. Ta en flue hetteglass med ca. 10 ml fast føde og legge til en liten mengde tørrgjær til det ene hjørnet, er nok mindre enn 1 g. Merk: For informasjon om flue ampuller eller mat se 'Drosophila vedlikehold "19. Legg 1 – 3 dråper vann for å hydrere gjær. Satt hetteglasset til side i 45 ° vinkel og tillate 3 – 5 min for gjæren til å ta opp vann. Mens gjær er absorbere vann, velge en flaske fluer uttrykker UASt- myr GCaMP5 20 drevet av kar-VP16GAL4 (referert til som GCaMP5) som nylig har dukket opp (en myristoynes form av GCaMP5 ble valgt for å gi et høyt signal-til-støy-forholdet ved forankring av de GECI til membranen i egget). Bedøver fluene i flasken med CO 2 gass. Sørg for å holde flasken snus for ikke å miste fluer i våtfôr. Tips bedøvet fluer på en CO 2 pad og sortere 10 – 15 kvinner og 5 menn som bruker en pensel under et dissekere mikroskop. Merk: Det er standard å inkludere menn å gi friske kvinner for disseksjon. Når flasken fra trinn 1.3 er klar, eller legge fluene til hetteglasset. Vær nøye med å holde hetteglasset horisontal før fluene blir aktive. Plasser flasken ved 25 ° C i ca. 36 timer. Gå tilbake de resterende fluer fra CO 2 pad til flasken eller forkaste. 2. dissekere Drosophila Eggstokkene Merk: Trinnene er beskrevet her er i samsvar med Weil et. al. <sopp> 18. Etter 36 timer, bedøver fluene fra yeasted hetteglass med CO 2. Når fluene inne i hetteglasset er bedøvet tipse dem på CO 2 pad som skal sorteres med en pensel under et dissekere mikroskop. Velg en kvinne. Isolere de to eggstokkene fra hunnen. For fullstendig detaljert protokoll se Weil et. al. 18. Oppsummert: En liten dråpe av oksygenert halogenkarbon olje (serie 95) på en nr 1,5, 22 x 40 mm dekkglass. Ta tak i kvinnelige med tang på fremre av magen. Hold kvinnelige under dissekere mikroskop, bruker det andre settet med pinsett for å forsiktig fjerne den bakre av de kvinnelige. Tørk av den bakre vev fra andre tang. Klem på magen hulrom med den andre tang fra fremre til bakre av magen. De to ugjennomsiktig eggstokkene bør holde seg til pinsett når utsiden av kvile. Trykk eggstokkene i oljen. Fjern alle vev fra tang ved å tørke av pinsett. Gjenta disse trinnene (2.4.1 – 2.4.7) for å få tre dekkglass som hver inneholder eggstokkene fra en flue. 3. Isola Individuell modne egg Under en standard dissekere mikroskop med forstørrelse satt til 4X, på den første dekkglass fra trinn 2.4, skiller de to eggstokkene ved å rive egglederen. Innføre et par lukkede tang inn i sentrum av en enkelt eggstokk, tar seg ikke å punktere eventuelle egg kamre. Sette inn en standard dissekere sonde inn i sentrum av eggstokk ved siden av de lukkede tang. Forsiktig dra dissekere sonde gjennom eggstokken mot bakre pol, hvor modne egg (scene 14 egg kamre) er plassert. Gjenta trinn 3,1 – 3,4 2-5 ganger avhengig av størrelsen av eggstokk og antallet egg. Merk: Tilsetning av CO 2 </sub> fører vanligvis avsetning av ett egg som vil se større ut med hevet rygg vedheng enn forhånds avsatt egg. Dette egg skal destrueres for bildebehandling, siden det allerede har blitt aktivert inne i hunnen. Merk: Eldre egg er sannsynlig å skille lett fra eggstokkene bindevev. Hvis ingen modne egg er synlige utenfor eggstokken, fortsetter forsiktig teasing med dissekere sonden. Når modne egg er synlige på dekkglass utsiden av eggstokk, manøvrere 3 – 5 i en linje i midten av dekkglass. Merk: For best resultat, kjøre sonden forsiktig langs siden av eggene. Merk: Unngå å trekke i rygg vedheng da dette kan skade egg. Merk: Avhengig av fremtiden bildebehandling satt opp, justere egg ca 200 mikrometer fra hverandre vinkelrett på dekkglass for maksimal bildeområdet. Når justert, fjerne resten av eggstokkvev ved å dra den bort fra de flukt egg ved hjelp av forceps. Fjern overflødig olje ved dabbing med hjørnet av en medisinsk tørke. Vær forsiktig så du ikke berører de modne eggene med det medisinske tørke som modne egg som blir kontaktet vil gå tapt. Tegn et trådkors på dekkglasset med en markør for å forenkle lokalisering av prøven under mikroskopet. Sett dekkglass på et trygt sted og la de forberedt egg kamre på dekkglass å hvile i 5 – 10 min. Dette gjør det mulig for egget å bosette seg i oljen. Prøvene kan brukes opp til en time etter disseksjon. Gjenta trinn 03.01 til 03.11 for resten av glassene med eggstokkene på dem. 4. Forberedelse til Imaging Bringe klare for aktivering buffer 15 til romtemperatur. Merk: Aktivering buffer er en hypotonisk buffer: 3,3 mM NaH 2PO 4, 16,6 mM KH 2PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyetylenglykol 8000, 2 mM CaCl2, brakt til pH 6,4 med en 1: 5 forholdet mellom NaOH: KOH.For mer informasjon se Mahowald, 1983 15. Porsjoner av aktivering buffer kan oppbevares ved -20 ° C i flere måneder, og ved 4 ° C i opptil to uker. Nøye transportere forberedt dekkglass, aktivering buffer og glass pipetter for bildestudio. Merk: Et bredt felt, konfokal, roterende disk eller lys ark mikroskop kan brukes. Vi anbefaler å bruke en invertert mikroskop. Våre representative resultater ble oppnådd ved bruk av et konfokalt mikroskop. En objektiv egnet for avbildning hele modne egg bør velges (her: 20X 0,7 NA). Monter første forberedt dekkglass på mikroskopet scenen. Pass på å ikke bryte glassene på scenen. Kvalitativt velge et synsfelt med et modent egg kammer for aktivering. Har ikke bildepunkterte egg kamre eller de med blebbing i membranen. Merk: For trinn 4,6 – 4,7, programvarekommandoer vil variere avhengig av mikroskop og produsent. Set bildebehandling parameter for standard GFP eksitasjon (488 nm) og utslipp (500-580 nm). Også satt opp en lyse-feltet visning for å visualisere og orientere den modne egg og fortrengt olje. Velg den laveste Z-planet hvor modne egg er synlige og sette en full Z-stack å bli tatt for 40 mikrometer på ca 2 mikrometer per trinn. Sett parametrene så det er ingen forsinkelse mellom Z-stack oppkjøpet. Sett tidsserier for å fange opp for ca 30 min. 5. Imaging Ex Vivo Egg Activation Begynn bildeopptak. Vent til 1 – 2 fulle Z-stabler å bli kjøpt opp. Dette viser den modne egg før aktivering. Trekke tilbake omtrent 300 ul av aktiveringsbuffer i et glass pipette. Å posisjonere spissen av pipetten glass inneholdende aktiveringsbuffer i 45 ° vinkel over dekkglass, sakte bevege pipetten inn i strålegangen til den er rett over det modne egg som avbildes. Glasset pipette børvære 1 – 2 cm over oljen. Legg 1 – 2 dråper aktiveringsbuffer i løpet av mindre enn 5 sekunder fra glasset pipette. Dette skal fortrenge oljen. Unngå å tilsette overskudd av aktiveringsbuffer eller berører egget med glasset pipette som det kan føre til forskyvning av det modne egg. Pass på å ikke ta på dekkglass med pipette, da dette kan føre til en endring i fokalplanet eller luftbobler dannes i immersjonsolje mellom objektiv og dekkglass. Mens legge aktivering buffer under bildet oppkjøpet, sjekk den lyse-feltet kanal for å sikre at oljen er blitt fortrengt av aktiverings buffer. Merk: Dette vil først vises som en skygge på grunn av pipetten bryte strålen banen, men vil også føre til utseendet av små oljedråper. Noen oljedråper kan forbli knyttet til modne egg som vil påvirke eksperimentelle resultater og bildekvalitet. Hvis oljen ikke blir forskjøvet fra den første tilsetning av aktiveringsbuffer gjenta trinn 5,4 til 50,6. Når oljen er vellykket fortrenges, tillate tidsseriene til å løpe til fullførelse. Merk: På grunn av hevelse av ubefruktede egg ved aktivering, vil noen egg kamre flytte dramatisk ut av fokusplan eller synsfelt ved tilsetting av aktivering buffer. I denne situasjonen, stanse gjennomføringen av oppkjøpet og monter neste dekkglass. Etter bildesekvensen har fullført oppkjøpet, lagre data. 6. Post-oppkjøpet Bildebehandling Åpne datasett ved hjelp av Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), eller tilsvarende bildebehandling, og velg de aktuelle filene for analyse. Å bygge en projeksjon av de innsamlede data velge: Image> Stabler> Z-prosjekt. Velg en start Z-skive og en stopp Z-skive, vanligvis hele seksjonen. Velg en projeksjon type, vanligvis satt til 'Max Intensitet'. Sjekk kryss 'All Time Frames "for å bruke de valgte innstillingene til hele serien. Hvismer enn en fluorescerende kanal har blitt fotografert, bruker kanaler verktøy for å muliggjøre bevegelse mellom farger, lage en kompositt eller gjøre bildet gråtoner. Velg Bilde> Farger> Kanaler verktøyet. For å justere lysstyrke og kontrast velger Bilde> Juster> Lysstyrke / kontrast. Slik eksporterer et enkelt bilde, flytter tidsskala glidebryteren til relevant ramme, og velg Fil> Lagre som> Jpeg, eller en hvilken som helst ønsket format. Velg et sted og tittel for den eksporterte filen, og deretter lagre. Merk Bildefrekvensen fra bildebehandlingsprogrammer vil være nødvendig for å gi et tidsstempel på bildet. Slik eksporterer tidsserien som en film velg Fil> Lagre som> AVI, velg bildefrekvens (~ 7 bilder per sekund). Velg et sted og tittel for den eksporterte filen, og deretter lagre. For å lagre den justerte filen i Fiji format, velger du Fil> Lagre.

Representative Results

Her har vi vist hvordan å forberede modne Drosophila egg for ex vivo aktivering. Egg uttrykker en GECI muliggjøre avbildning av Ca 2+ dynamikk på egg aktivisering og begynnelsen av embryoutvikling (figur 1). Det skal bemerkes at avhengig av GCaMP anvendes, spesielt nærværet av en myristoyl- gruppe, kan resultatene ha små kvalitative forskjeller 13 14. Vi har også demonstrert en rolle for funksjonell aktin i løpet av egg aktivering ved tilsetning av en inhibitor av aktin polymerisering cytokalasin D, til aktiveringsbuffer (figur 2) 14. Et krav for cytoskjelettet på egg aktivisering er bevart. I C. elegans, etter befruktning, er cytoskeletal komponenter omorganisert for å forberede en celle embryo for første asymmetrisk divisjon 21,22. I kråkebolle, forstyrrelse av cytoskeletal re-organisasjon etter aktivering har vist seg å påvirke cellesyklus ved å forhindre kontraktile ringdannelse 23. Rollen til actin i å mediere en Ca2 + bølge og dens nedstrøms funksjon ved egg aktivering i Drosophila fremdeles ikke helt klarlagt. I Drosophila, kan ko-visualisering av Ca 2 + bølge og aktin cytoskjelettet oppnås ved hjelp av denne ex vivo-aktiveringstest. Tidsserier av flere kanaler kan bli kjøpt og dynamikken i intracellulær Ca 2+ kan matches med endringer i aktin organisasjon i eggcelle (figur 3). Figur 1:. A Single Ca 2+ bølgen ved Drosophila Egg Aktivering Tidsserier av ex vivo modne Drosophila egg uttrykke UASt- myrGCaMP5 etter enapparat.Foruten av aktiveringsbuffer (AH). Økningen i cytoplasmisk Ca2 + stammer ved bakre pol (B) og forplanter seg (BF) med en gjennomsnittlig hastighet på omtrent 1,5 um / sek. Initiering av bølgen blir vanligvis observert i løpet av 3 minutter fra tilsetningen av aktiveringsbuffer. Etter aktivering, de intracellulære kalsiumnivåer i det modne egg til nivået før aktiveringsnivå (G, H). Se supplerende film 1 (total tid 33 min). Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Tilsetning av Cytochalasin D til aktiverings Buffer perturbs Ca2+ Wave Propagation. Tids serie av ex vivo modne Drosophila egg som uttrykker UASt- myrGCaMP5 etter tilsetning av aktiveringsbuffer inneholdende 10 pg / ml cytokalasin D sluttkonsentrasjon (AH). Mens Ca 2+ bølge blir initiert ved den bakre pol (A), er det kompromittert, og når ikke den fremre av egg (F) (hvite pilspisser angir fronten av bølgen). Ikke lenger ble observert Ca 2+ forandringer i løpet av 30 min). Se supplerende filmen 2 (total tid 30 min). Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: Co-visualisering av aktin og Ca 2+ på Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier av ex vivo modne Drosophila egg uttrykker UASt- myrGCaMP5 (cyan) og UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) etter tilsetning av aktivering buffer (AH). Ca 2+ bølge initierer fra den bakre stang og gjenoppretter som i figur 1. Aktin ser ut til å endre seg med tid, hvite pilspisser (A vs H). Mangelen på Ca 2+ signaldeteksjon i sentrum av det modne egget er på grunn av bevegelse av prøven under bildetagning. Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.

Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca²⁺ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.

Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.

This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited ¹³, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.

There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca²⁺ wave in mutant backgrounds ^14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca²⁺ wave.

Materials

Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
		Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80mm x 25mm