Imaging kalcium i<em> Drosophila</em> Vid Egg Aktivering

Summary

Den här artikeln beskriver en anpassningsbar ex vivo protokoll för att visualisera Ca2 ⁺ under ägg aktivering i Drosophila.

Abstract

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca²⁺) often termed a ‘Ca²⁺ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca²⁺ wave varies between species, the change in intracellular Ca²⁺ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.

In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca²⁺-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca²⁺ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca²⁺ wave and the downstream changes associated with it.

Introduction

En förändring av intracellulär Ca2 ⁺ -koncentration på ägg (oocyt) aktivering är en konserverad komponent i alla studerade organismer ^1,2. Denna händelse initierar ett brett spektrum av Ca2 ⁺ -beroende processer, inklusive återupptagande av cellcykeln och översättning av lagrade mRNA. På grund av detta krav på Ca2 ^+, visualisera övergående förändringar i intracellulära Ca ^{2 +} koncentrationer har varit av avgörande intresse.

Historiskt sett har modellorganismer ut för studier på ägg aktivering utifrån storleken och tillgängligheten av deras ägg. Olika visualiseringsmetoder har använts för att följa och kvantifiera förändringar i intracellulär Ca2 ⁺ koncentrationer i dessa system, inklusive: fotoproteinet aequorin i medaka fisk ^3; Ca2 ⁺ känsliga fluorescerande färgämnen som Fura-2 i sjöborre och hamster ^4,5; och kalcium grön-en-dextran i Xenopus ^6.

Genereringen och förbättring av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) har förändrat möjligheten att visualisera Ca2 ⁺ dynamiken in vivo ^7. Dessa genetiska konstruktioner uttrycks i specifika vävnader och begränsa behovet av invasiva vävnadsberedningar ^8.

GCaMPs är ett grönt fluorescerande protein (GFP) -baserad klass av GECIs som har varit mycket effektiv på grund av deras höga Ca ^{2 +} affinitet, att signal-till-brusförhållande och kapacitet kan anpassas ^9-11. I närvaro av Ca2 ^+, undergår GCaMP komplexet en serie av konformationsförändringar, med början med bindningen av Ca ²⁺ till kalmodulin, som resulterar i en ökad fluorescensintensitet av GFP-komponenten ^9.

GCaMPs har i stor utsträckning använts i forskning om Drosophila nervceller att visualisera förändringar i intracellulär kalcium ^12. De senaste applicatining GCaMP teknik för att visualisera Ca2 ⁺ i mogna Drosophila ägg har avslöjat en enda transient Ca2 ⁺ våg på ägg aktivering ^13,14. Ca2 ⁺ våg kan visualiseras vid låg förstoring under ägglossning in vivo ¹³ eller högre förstoring med hjälp av en ex vivo aktiveringsanalys ^13,14. I ex vivo-analysen är individuella mogna oocyter isolerades från äggstockar och aktiveras med hjälp av en hypoton lösning, kallad aktiveringsbuffert, som har visat sig rekapitulera händelserna av in vivo-aktivering ^15-17.

Detta ex vivo assay möjliggör enkel hög upplösning visualisering av Ca2 ⁺ våg under olika experimentella förhållanden inklusive farmakologisk störningar, fysiska manipulationer och genetiska mutanter. Den här artikeln visar framställningen av mogna Drosophila ägg för ex vivo aktivering och the efterföljande mikroskopi används för att visualisera den Ca2 ⁺ våg med användning GCaMP. Denna metod kan användas för att testa initiering och kontroll av Ca2 ⁺ vågen och att undersöka resultat nedströms.

Protocol

Obs: Utför alla steg vid rumstemperatur om inget annat anges. 1. Förberedelser för Dissection Obs: De steg som beskrivs här är i enlighet med E. Gavis, Princeton University och Weil et. al. 18. Utför följande steg två dagar innan avbildning. Ta en fluga flaska innehållande ca 10 ml av fast föda och tillsätt en liten mängd torrjäst till ett hörn, är mindre än 1 g tillräcklig. Obs: information om flyga flaskor eller mat se för "Drosophila underhåll" 19. Tillsätt 1 – 3 droppar vatten för att hydratisera jäst. Ställa flaskan åt sidan vid en 45 ° vinkel och tillåta 3-5 min för jästen att ta upp vattnet. Medan jästen är absorbera vatten eller för att välja en flaska av flugor som uttrycker UASt- myr GCaMP5 20 driven av tub-VP16GAL4 (kallad GCaMP5) som nyligen har uppstått (a myristoyrade formen av GCaMP5 valdes för att ge en hög signalbrusförhållande genom att tjudra den GECI till membranet i ägget). Bedöva flugorna i flaskan med CO2 gas. Var noga med att hålla flaskan inverterad för att inte förlora flugor i våtfoder. Tippa sövda flugor på en CO 2 pad och sortera 10 – 15 kvinnor och 5 män med hjälp av en pensel under ett dissektionsmikroskop. Obs: Det är standard att inkludera män att ge friska kvinnor för dissekering. När flaskan från steg 1,3 är redo, lägga till de valda flugor till flaskan. Var noga med att hålla flaskan horisontellt tills flugorna blir aktiva. Placera flaskan vid 25 ° C i ungefär 36 timmar. Återlämna resterande flugor från CO 2 pad till flaskan eller kassering. 2. Dissecting Drosophila Äggstockar Obs: De steg som beskrivs här är i enlighet med Weil et. al. <supp> 18. Efter 36 timmar, söva flugor från yeasted flaskan med CO2. När flugorna inuti flaskan bedövas tippa dem på CO 2 pad redas med en pensel under ett dissektionsmikroskop. Välj en hona. Isolera de två äggstockarna från honan. För fullständig detaljerat protokoll se Weil et. al. 18. Sammanfattningsvis: Placera en liten droppe av syreHaloCarbon olja (serie 95) på en nr 1,5, 22 x 40 mm täckglas. Ta tag i hona med pincett vid den främre av buken. Håller honan under dissekera mikroskop, använder den andra uppsättningen av pincett för att försiktigt ta bort den bakre delen av kvinnligt. Torka av den bakre vävnad från den andra pincett. Pressa på buken kavitet med den andra pincett från den främre till den bakre delen av buken. De två ogenomskinliga äggstockarna bör hålla sig till tången när utanför FEMAle. Tryck på äggstockarna i oljan. Ta bort alla vävnader från tången genom att torka bort tången. Upprepa stegen (2.4.1 – 2.4.7) för att erhålla tre täck, var och en innehållande äggstockar från en fluga. 3. Isolera enstaka mogna ägg Under en vanlig dissekera mikroskop med förstoringen inställd på 4X, på den första täck från steg 2,4, separera de två äggstockarna genom att riva äggledaren. Införa ett par slutna pincett i mitten av en enda äggstock, noga med att inte punktera några ägg kammare. Sätt en standard dissekera sond i mitten av äggstocken bredvid de stängda pincett. Dra försiktigt dissekera sonden genom äggstocken mot bakre stolpen, där de mogna ägg (stadium 14 ägg kammare) finns. Upprepa steg 3,1 – 3,4 2-5 gånger beroende på storleken av äggstocken och antalet ägg. Obs: Tillsats av CO 2 </sub> orsakar vanligen avsättning av ett enda ägg som kommer att visas större med höjda rygg bihang än deponerats i förväg ägg. Detta ägg ska kasseras för avbildning, eftersom det redan har aktiverats inuti honan. Obs: Mogna ägg sannolikt att skilja enkelt från äggstocks bindväv. Om inga mogna ägg är synliga utanför äggstocken, fortsätter försiktigt retas med dissekera sonden. När mogna ägg syns på täck utanför äggstocken, manövrera 3-5 i en linje i mitten av täck. Obs: För bästa resultat, kör sonden försiktigt längs sidan av äggen. Obs: Undvik att dra på rygg bihang eftersom det kan skada ägget. Obs! Beroende på den framtida imaging set-up, anpassa ägg ungefär 200 pm från varandra vinkelrätt mot täck för maximal bildyta. När linje, ta bort resten av äggstocksvävnad genom att dra bort den från de inriktade ägg med hjälp av forceps. Ta bort överflödig olja genom att badda med hörnet av ett medicinskt torka. Var noga med att inte röra de mogna ägg med den medicinska torka som mogna ägg som kontaktas kommer att gå förlorade. Rita ett hårkors på täckglas med en markör för att förenkla placering av provet under mikroskop. Ställ täck på en säker plats och lämna de preparerade ägg kamrarna på täck vila i 5-10 minuter. Detta gör det möjligt för ägget att bosätta sig i oljan. Prover kan användas upp till en timme efter dissekering. Upprepa steg från 3,1 till 3,11 för resten av täck med äggstockar på dem. 4. Förberedelser för Imaging Föra beredda aktiveringsbuffert 15 till rumstemperatur. Obs: Aktivering buffert är en hypoton buffert: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyetylenglykol 8000, 2 mM CaCl2, till pH 6,4 med en 1: 5 förhållandet mellan NaOH: KOH.För mer information, se Mahowald, 1983 15. Alikvoter av aktiveringsbuffert kan förvaras vid -20 ° C i flera månader och vid 4 ° C i upp till två veckor. transportera noggrant förberedda täck, aktiveringsbuffert och glaspipetter till avbildning anläggning. Obs: Ett brett fält, konfokala, snurrande skiva eller ljus ark mikroskop kan användas. Vi rekommenderar att du använder ett inverterat mikroskop. Våra representativa resultat erhölls med användning av ett konfokalt mikroskop. En målsättning är lämplig för avbildning av hela den mogna ägg bör väljas (här: 20X 0,7 NA). Montera första förberedda täck på mikroskop scenen. Se till att inte bryta täck på scenen. Kvalitativt välja ett synfält med ett moget ägg kammare för aktivering. Do inte bildpunkteras ägg kamrarna eller de med blåsbildning i membranet. Obs! Steg 4,6 – 4,7, programvarukommandon varierar beroende på mikroskop och tillverkare. Uppsättning avbildnings paramätare för standard GFP excitation (488 nm) och emission (500-580 nm). Också inrätta en ljus-fältet Visa för att visualisera och orientera den mogna ägg och fördrivna olja. Välj lägsta Z-planet där mogna ägg är synliga och ange en fullständig Z-stack tas för 40 pm till cirka 2 pm per steg. Ställ in parametrarna så det finns ingen fördröjning mellan Z-stack förvärvet. Ställa in tidsserien för att fånga under ca 30 min. 5. Imaging Ex Vivo Egg Aktivering Börja ta bilder. Vänta 1 – 2 fulla Z-stackar som skall förvärvas. Detta visar den mogna ägg före aktivering. Återkalla cirka 300 pl aktiveringsbuffert i ett glas pipett. Placering av spetsen på glaspipett innehållande aktiveringsbuffert vid 45 ° vinkel ovanför täck, sakta pipetten i strålgången tills det är direkt ovanför den mogna ägg som avbildas. Glaspipett börvara 1 – 2 cm ovanför oljan. Tillsätt 1 – 2 droppar av aktiveringsbuffert på mindre än 5 sek från glaspipett. Detta bör förskjuta oljan. Undvik att lägga överskott aktiveringsbuffert eller röra ägget med glaspipett eftersom det kan orsaka förskjutning av mogna ägg. Se till att inte röra täck med pipetten eftersom detta kan orsaka en förändring i Focal Plane eller luftbubblor bildas i immersionsolja mellan målet och täck. Under tillsats av aktiveringsbuffert under bildinhämtning, kontrollera ljusfält kanal för att säkerställa att oljan har förskjutits av aktiveringsbuffert. Notera: Detta kommer först att visas som en skugga på grund av pipetten att bryta strålen banan men kommer också att resultera i uppkomsten av små oljedroppar. Vissa oljedroppar kan förbli i samband med den mogna ägg som kommer att påverka experimentella resultat och bildkvalitet. Om oljan inte är förskjuten från den initiala tillsatsen av aktiveringsbuffert upprepa steg 5,4-50,6. När oljan är framgångsrikt förskjuts, låta tidsserier löpa intill dess. Obs: På grund av svullnad av äggceller vid aktivering, kommer vissa ägg kammare flytta dramatiskt ur fokalplanet eller synfält vid tillsats av aktiveringsbuffert. I denna situation, stoppa förvärv och montera nästa täckglas. Efter bildsekvensen har slutfört förvärvet, spara data. 6. Post-förvärv bildbehandling Öppna datamängden med hjälp av Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), eller motsvarande bildbehandlingsprogram, och välj de relevanta filerna för analys. Att bygga en projektion av de insamlade data väljer: Bild> Staplar> Z-projektet. Välj en start Z-skiva och en stopp Z-skiva, typiskt hela avsnittet. Välj en projektion typ, typiskt satt till "Max Intensity. Kontrollera kryssrutan "All Time Frames" för att tillämpa de valda inställningarna för hela serien. Ommer än en fluorescerande kanal har avbildats använder kanaler verktyget för att möjliggöra rörelse mellan färger, göra en komposit, eller göra bilden gråskala. Välj Bild> Colors> Kanaler verktyg. Att justera ljusstyrka och kontrast väljer Bild> Justera> Ljusstyrka / Kontrast. För att exportera en enda bild, flyttar tidsskalan reglaget till relevant ram och välj Arkiv> Spara som> Jpeg, eller någon önskat format. Välj en plats och titel för den exporterade filen, spara. Obs Bildhastigheten från bildbehandlingsprogram kommer att krävas för att ge en tidsstämpel på bilden. Att exportera tidsserierna som en film väljer Arkiv> Spara som> AVI, välj sedan bildhastighet (~ 7 bilder per sekund). Välj en plats och titel för den exporterade filen, spara. För att spara justerade filen i Fiji format väljer du Arkiv> Spara.

Representative Results

Här har vi visat hur man förbereder mogna Drosophila ägg för ex vivo aktivering. Ägg som uttrycker en GECI möjliggöra avbildning av Ca2 + dynamiken på ägg aktivering och början av embryonal utveckling (Figur 1). Det bör noteras att beroende på GCaMP användes, specifikt närvaron av en myristoyl-grupp, kan resultaten ha små kvalitativa skillnader 13 14. Vi har också visat en roll för funktionell aktin under ägg aktivering genom tillsats av en inhibitor av aktin polymerisation, cytochalasin D, till aktiveringsbuffert (figur 2) 14. En förutsättning för cytoskelettet på ägg aktivering bevaras. I C. elegans, efter befruktningen, cytoskelettala komponenter omorganiseras för att framställa en cell embryo för första asymmetriska division 21,22. I sjöborre, störningar i cytoskeletal omorganisation efter aktivering har visat sig påverka cellcykeln genom att förhindra kontraktila ringbildning 23. Rollen av aktin i medla en Ca2 + våg och dess nedströms funktion på ägg aktivering i Drosophila fortfarande inte helt klarlagd. I Drosophila, kan uppnås samtidig visualisering av Ca2 + vågen och aktincytoskelettet med användning av denna ex vivo aktiveringsanalys. Tidsserier av flera kanaler kan förvärvas och dynamiken i den intracellulära Ca2 + kan matchas med förändringar i aktin organisation i äggcellen (Figur 3). Figur 1:. En enda Ca2 + Wave på Drosophila Egg Aktivering Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 efter enddition aktiveringsbuffert (AH). Ökningen av cytoplasma Ca2 + ursprung på den bakre stolpen (B) och propagerar (BF) med en medelhastighet på ungefär 1,5 pm / sek. Initiering av vågen typiskt observeras inom 3 min av tillsatsen av aktiveringsbuffert. Efter aktivering, de intracellulära kalciumnivåer i den mogna ägget återgår till pre-aktiveringsnivåer (G, H). Se kompletterande filmen 1 (total tid 33 minuter). Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Tillägg av Cytochalasin D till aktiveringsbuffert stör Ca2+ vågutbredning. Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 efter tillsats av aktiveringsbuffert innehållande 10 pg / ml cytochalasin D slutlig koncentration (AH). Medan Ca2 + vågen initieras vid den bakre stolpen (A), är det äventyras och inte når den främre av ägget (F) (vita pilspetsar beteckna den främre delen av vågen). Ingen ytterligare Ca2 + förändringar observerades under 30 min). Se kompletterande filmen 2 (total tid 30 minuter). Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Co-visualisering av aktin och Ca2 + vid Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 (cyan) och UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) efter tillsats av aktiveringsbuffert (AH). Ca2 + våg initierar från den bakre polen och återvinner som i figur 1. Actin verkar vara förändras över tiden, vita pilspetsar (A vs H). Avsaknaden av Ca2 + signaldetektering i centrum av den mogna ägget är på grund av rörelse av provet under bildinfångnings. Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.

Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca²⁺ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.

Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.

This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited ¹³, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.

There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca²⁺ wave in mutant backgrounds ^14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca²⁺ wave.

Materials

Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
		Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80mm x 25mm