Görüntüleme Kalsiyum<em> Drosophila</em> Yumurta Aktifleştirme de

Summary

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında ²⁺ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Abstract

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca²⁺) often termed a ‘Ca²⁺ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca²⁺ wave varies between species, the change in intracellular Ca²⁺ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.

In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca²⁺-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca²⁺ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca²⁺ wave and the downstream changes associated with it.

Introduction

Yumurta (oosit) aktivasyonu A hücre içi Ca değişim ²⁺ konsantrasyon tüm çalışılan organizmaların ^1,2 korunmuş bir bileşenidir. Bu olay, hücre döngüsü yeniden başlatılması ve depolanan mRNA çevirisi de dahil olmak üzere, Ca ^{2 +} -bağımlı süreçler, geniş bir yelpazede başlatır. Nedeniyle hücre içi Ca ^{2 +} konsantrasyonlarda geçici değişiklikler görselleştirme Ca ²⁺ için bu şartı, anahtar ilgi olmuştur.

Tarihsel olarak, Model canlılar kendi yumurta büyüklüğüne ve durumuna bağlı olarak yumurta aktivasyonu üzerinde çalışmalar için seçildi. Çeşitli görselleştirme yaklaşımlar da dahil olmak üzere, bu sistemlerde ^{2 +} konsantrasyonları takip ve hücre içi Ca değişiklikleri ölçmek için kullanılmıştır: Medaka balık ³ photoprotein aequorin; Böyle Fura-2 deniz kestanesi ve hamster ^4,5 gibi ca ²⁺ duyarlı floresan boyalar; ve kalsiyum-yeşil 1-dekstran Xenopus ^6.

Üretim ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) iyileştirilmesi vivo ⁷ Ca ^{2 +} dinamiklerini görselleştirmek için yeteneği dönüştürdü. Bu genetik yapılar belirli dokularda ifade ve invaziv doku hazırlıkları ⁸ ihtiyacını sınırlamak vardır.

GCaMPs nedeniyle yüksek Ca ^{2 +} afinite çok etkili olmuştur Geçiş yeşil flüoresan proteini (GFP) merkezli sınıf, sinyal-gürültü oranı ve kapasite ^9-11 özelleştirilmesi için. Ca ^{+ 2} varlığında, GCaMP kompleksi, kalmodulin Ca ²⁺ bağlanması ile başlayan yapısal bir dizi değişiklik maruz GFP bileşen ⁹ artmış floresan yoğunluğu ile sonuçlanır.

GCaMPs yoğun hücre içi Kalsiyum ¹² değişiklikleri görselleştirmek için Drosophila nöronlar üzerindeki araştırmalarda kullanılmıştır. son UygOlgun Drosophila yumurta ²⁺ Ca görselleştirmek için GCaMP teknoloji yumurta aktivasyonu ^13,14 tek bir geçici Ca ^{2 +} dalga ortaya koymuştur. Ca ^{2 +} dalga bir ex vivo aktivasyon tahlil ^13,14 kullanarak in vivo ¹³ yumurtlama sırasında ya da daha yüksek büyütmede düşük büyütme görülebilir. Ex vivo deneyde, tek tek, olgun oosit överlerden izole edildi ve hipotonik bir solüsyon kullanılarak çalıştırılır, in vivo aktive ^15-17 olaylarını özetlemek gösterilmiştir aktivasyon tamponu olarak anılacaktır.

Bu ex vivo deney farmakolojik bozulma, fiziksel manipülasyonlar ve genetik mutantlar dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında Ca ^{2 +} dalganın kolay yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. Bu makale ex vivo aktivasyonu ve th için olgun Drosophila yumurta hazırlanmasını göstermektedirGCaMP kullanarak Ca ^{2 +} dalga görselleştirmek için kullanılan e sonraki mikroskopi. Bu yaklaşım Ca ^{2 +} dalganın başlaması ve kontrolünü test etmek ve alt sonuçlarını araştırmak için kullanılabilir.

Protocol

Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 1. Diseksiyon için hazırlanıyor Not: Burada anlatılan adımlar E. Gavis, Princeton Üniversitesi'nden & Weil et ile uyumludur. ark. 18. görüntüleme önce aşağıdaki adımları iki gün uygulayın. Katı gıda yaklaşık 10 ml ihtiva eden bir uçucu şişeye alın ve bir köşede kurutularak maya küçük bir miktar eklemek, 1 g yeterlidir. Not: sinek şişeleri ya da gıda hakkında bilgi 'Drosophila Bakım' 19 için bkz. maya hidrat 3 damla su – 1 eklenir. 45 ° açıyla kenara flakon ayarlayın ve 3 izin – su almak için maya için 5 dk. Maya su emici olsa da, (en son ortaya çıkmıştır ki (GCaMP5 olarak da adlandırılır), bir myristoy küvet-VP16GAL4 tahrik UASt- MYR GCaMP5 20 eksprese eden sineklerin bir şişe seçinGCaMP5 arasında yonunun formu) yumurta membrana Geci cepheye ile gürültü oranı yüksek bir sinyal sağlamak için seçilmiştir. CO 2 gazı ile şişe içinde sinekler Anesteziyoloji. Islak gıda sinekler kaybetmek olmayacak şekilde ters şişe tutmak için emin olun. CO 2 ped üzerine anestezi sinekler İpucu ve sıralama 10-15 kadın ve bir mikroskop altında bir fırça kullanarak 5 erkek. Not: diseksiyon için sağlıklı kadın temin etmek erkekleri kapsayacak şekilde standarttır. Adım 1.3 şişe hazır olduğunda, flakon seçilen sinekler ekleyin. sinekler aktif hale gelene kadar şişe yatay tutmak için özen gösterin. Yaklaşık 36 saat boyunca 25 ° C'de şişe yerleştirin. Şişe veya ıskarta CO 2 pad kalan sinekler dönün. 2. Diseksiyon Drosophila Ovaryumlar Not: Burada tarif edilen adımlar, Weil ve diğerleri ile uyumludur. ark. <s> 18 kadar. 36 saat sonra, CO 2 ile mayalı flakonundan sinekler uyuşturan. Flakon içindeki sinekler CO 2 ped üzerine bunları İpucu anestezi sonra bir mikroskop altında bir boya fırçası ile sıralanacak. Bir kadın seçin. kadın iki yumurtalıklar izole edin. Tam detaylı protokol için Weil bakınız. ark. 18. Özetle: No. 1.5, 22 x 40 mm örtücü kısım üzerine oksijenli halokarbon bir yağ (Seri 95) küçük bir damla koyun. Karın anterior forseps ile dişi kavrayın. Diseksiyon mikroskobu altında kadın tutarak, yavaşça dişinin posterior kaldırmak için forseps ikinci seti kullanın. İkinci forseps posterior doku siliniz. Karın posterior anterior ikinci forseps ile karın boşluğuna sıkın. İki opak yumurtalıkların zaman FEMA dışında forseps ayrılmamak gerekirle. yağın içine yumurtalıklar dokunun. forseps kapalı silerek forseps herhangi bir doku çıkarın. bir sinek, üç lamelleri elde etmek için her içeren yumurtalık – Bu adımları (2.4.7 2.4.1) tekrarlayın. 3. Ayırma Bireysel Olgun Yumurta Adım 2.4 ilk lamel, 4X ayarlanmış büyütme ile standart bir mikroskop altında, yumurtalık yırtarak iki yumurtalık ayırın. herhangi bir yumurta odaları delinme özen tek yumurtalık merkezi haline kapalı forseps bir çift tanıtmak. Bir sonraki kapalı forseps yumurtalık merkezine standart bir diseksiyon probu yerleştirin. Yavaşça olgun yumurta (evre 14 yumurta odaları) bulunduğu arka kutup, doğru yumurtalık yoluyla diseksiyon prob sürükleyin. Tekrar 3.1 adımları – 3,4 2-5 kat yumurtalık ve yumurta sayısı boyutuna bağlı olarak değişir. Not: CO2 ilavesi </sub> tipik önceden yatırılan yumurtalardan daha yükseltilmiş dorsal uzantıları ile büyük görünecek tek bir yumurta birikimi neden olur. Zaten kadın içinde aktif beri Bu yumurta görüntüleme için atılmalıdır. Not: Olgun yumurta yumurtalık bağ dokusu kolayca ayırmak için muhtemeldir. Hiçbir olgun yumurta yumurtalık dışında görünür durumdaysa, diseksiyon prob ile alay yavaşça devam ediyor. lamel merkezinde bir çizgi 5 – olgun yumurta yumurtalık dışında lamel görünür olduğunda, 3 manevra. Not: En iyi sonucu elde etmek için, yumurta kenarı boyunca yavaşça prob çalıştırın. Not: Bu yumurtayı zarar verebileceği dorsal uzantıları çekerek kaçının. Not: Gelecekteki görüntüleme set-up bağlı olarak maksimum görüntüleme alanı için lamel dik yaklaşık 200 mikron ayrı yumurta hizalayın. hizalanmış sonra, f kullanılarak hizalanmış yumurta uzağa sürükleyerek yumurtalık dokusunun geri kalanını kaldırmakorceps. Tıbbi silme köşesinde ile dabbing fazla yağı çıkartın. Tıbbi kaybolur temas gibi olgun yumurta silin olgun yumurta dokunmamaya özen gösterin. mikroskop altında örnek bulma basitleştirmek için bir işaretleyici ile lamel bir crosshair çizin. güvenli bir yerde lamel ayarlayın ve 5 için dinlenmek için lamel hazırlanan yumurta odaları bırakın – 10 dakika. Yumurta yağda yerleşmek için bu izin verir. Numuneler 1 saat sonrası diseksiyonu kadar kullanılabilmektedir. onlara yumurtalıkların ile lamelleri geri kalanı için 3.11 – Tekrar 3.1 adımları. 4. Görüntüleme için hazırlanıyor Oda sıcaklığına hazırlanan aktivasyon tamponu 15 getirin. Not: aktivasyon tamponu hipotonik tampon maddesi olup: 3.3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCI, 50 mM KCI, bir 1 ile pH 6.4'e getirildi, 5% polietilen glikol 8000, 2 mM CaCl2,: NaOH 5 oranı: KOH.Daha fazla bilgi için Mahowald, 1983 15. Aktivasyon tamponu alikoları en fazla 2 hafta içinde C ay boyunca 4 ° C'de -20 ° C'de saklanabilir. Dikkatle görüntüleme tesisine hazırlanan lamelleri, aktivasyon tampon ve cam pipetler taşıyın. Not: Bir geniş alan, konfokal, eğirme disk veya hafif levha mikroskop kullanılabilir. Biz ters bir mikroskop kullanılarak öneririz. Bizim Örnek sonuçlar konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. tüm olgun yumurta görüntüleme için uygun bir hedef (burada: 20X 0.7 NA) seçilmelidir. Mikroskop sahneye ilk hazır lamel monte edin. Sahnede lamelleri kırmamaya özen gösterin. Kalitatif aktivasyon için olgun bir yumurta haznesi ile bir görüş alanı seçin. Görüntü delinmiş yumurta odaları veya zarında blebbing olanlar etmeyin. Not: adımlar 4.6 için – 4.7, yazılım komutları mikroskop ve üreticiye bağlı olarak değişir. Set görüntüleme para(- 580 ila 500 nm) standart GFP uyarılma (488 nm) ve emisyon metre. Ayrıca olgun yumurta ve yerinden yağ görselleştirmek ve yönlendirmek amacıyla bir aydınlık alan görünümü kurdu. Tam Z-yığını olgun yumurta görünür düşük Z-düzlemini seçin ve ayarlayın adım başı 40 mikron yaklaşık 2 mikron için alınacak. Z-yığını edinimi arasında hiçbir gecikme yok yani parametreleri ayarlayın. Yaklaşık 30 dakika boyunca yakalamak için zaman serisi ayarlayın. 5. Görüntüleme Ex Vivo Yumurta Aktivasyon görüntü yakalama başlatın. 2 tam Z-yığınlar elde edilecek – 1 bekleyin. Bu aktivasyon öncesinde olgun yumurta gösterir. Bir cam pipet içine aktivasyon tampon yaklaşık 300 ul çekin. olgun yumurta görüntülü doğrudan yukarıda kadar lamel üzerinde 45 ° 'lik açıyla aktivasyon tampon içeren cam pipet ucu konumlandırma, yavaş yavaş ışın yoluna pipet hareket ettirin. Cam pipet gerekirBu yağ, 2 cm – 1 olabilir. cam pipet en fazla 5 saniye içinde aktivasyon tamponu 2 damla – 1 eklenir. Bu yağ yerinden gerekir. aşırı aktivasyon tampon ekleyerek veya olgun yumurta değiştirmesine neden olabilir cam pipet ile yumurta dokunmaktan kaçının. Bu amaç ve lamel arasındaki immersiyon oluşturmak için odak düzlemi veya hava kabarcıkları bir değişiklik neden olabilir pipet ile lamel dokunmamaya özen gösterin. görüntü alımı sırasında aktivasyon tampon ekleyerek iken, yağ aktivasyon tampon yerinden edilmiş olmasını sağlamak için parlak alan kanalı kontrol. Not: Bu ilk nedeni ışın yolu kırma pipet bir gölge olarak görünür ama aynı zamanda küçük yağ damlacıkları görünümünü neden olacaktır. Bazı yağ damlacıkları deneysel sonuçları ve görüntü kalitesini etkiler olgun yumurta ile ilişkili kalabilir. 5 – Yağ aktivasyon tampon tekrar ilk ilavesiyle yerinden değilse 5.4 adımları0,6. Yağ başarıyla yerinden sonra, zaman serisi tamamlanana kadar çalışmasına izin verin. Not: aktivasyonu oosit şişlik, bazı yumurta odaları aktivasyon tampon ilavesi üzerine odak düzlemi veya görüş alanının dışında önemli ölçüde hareket edecektir nedeniyle. Bu durumda, satın durdurmak ve bir sonraki lamel monte edin. görüntü sırası alımını tamamlandıktan sonra, verileri kaydetmek. 6. Post-satın alma Görüntü İşleme Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) veya eşdeğer görüntü işleme yazılımı kullanarak veri seti açın ve analiz için ilgili dosyaları seçin. elde edilen verilerin bir projeksiyon oluşturmak için seçin: Image> Yığınlar> Z proje. Bir başlangıç ​​Z-dilim ve bir stop Z-dilim, genellikle bütün bölümünü seçin. tipik 'Maksimum Şiddeti' olarak ayarlanmış bir projeksiyon türü seçin. dizi için seçilen ayarları uygulamak için onay kutusu 'Tüm Zamanların Çerçeveler' kontrol edin. EğerBirden fazla floresan kanal kompozit yapmak, renkler arasındaki hareketi sağlamak için Kanallar aracını kullanın ya da görüntü gri tonlama yapmak, görüntülenmiştir edilmiştir. Resim Seç> Renkler> Kanallar aracı. Görüntü parlaklığını ayarlamak basıp Görüntü kontrast>> Parlaklık / Kontrast ayarlama için. tek bir görüntü vermek için, ilgili çerçeve ve Dosya> Farklı Kaydet> JPEG, ya da herhangi bir tercih edilen biçimine zaman ölçeği kaydırıcıyı hareket ettirin. Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. görüntüleme yazılımından kare hızını Not resmin üzerine bir zaman damgası vermek için gerekli olacaktır. bir film olarak zaman serisini vermek için seçin: Dosya> Farklı Kaydet> AVI, sonra (~ saniyede 7 kare) kare hızını seçin. Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. Fiji formatında düzeltilmiş dosyayı kaydetmek için, Dosya> Kaydet.

Representative Results

Burada ex vivo aktivasyonu için olgun Drosophila yumurta nasıl hazırlanacağını göstermiştir. 2+ dinamikleri yumurta aktivasyonu Ca bir GECI sağlayacak görüntüleme ve embriyonik gelişim başlangıcı (Şekil 1) ifade yumurta. GCaMP bağlı özellikle miristoil grubunun varlığı sonuçları hafif niteliksel farklılıklar 13 14 sahip olabilir, kullanılan not edilmelidir. Ayrıca aktin polimerizasyon inhibitörünün eklenmesiyle yumurta aktivasyonu sırasında fonksiyonel aktin rol göstermiştir, cytochalasin D, aktivasyon tampon (Şekil 2) 14. Yumurta aktivasyonu hücre iskeletinin için bir gereklilik korunur. C. elegans, gübreleme sonrasında iskelet parçaları ilk asimetrik bölünme 21,22 için tek hücreli embriyo hazırlamak için yeniden düzenlenir. cytoskele deniz kestanesi olarak, bozulmaaktivasyon aşağıdaki tal yeniden organizasyon kasılma halka oluşumunu 23 önleyerek hücre döngüsünü etkilediği gösterilmiştir. Ca 2 + dalga ve Drosophila yumurta aktivasyonu onun aşağı fonksiyonunu aracılık aktin rolü tam olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Drosophila olarak, Ca2 + ve dalga aktin hücre iskeletinin co-görselleştirme bu ex vivo aktivasyon tahlili kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla kanal Zaman serisi elde edilebilir ve hücre içi Ca 2+ dinamikleri oosit (Şekil 3) aktin organizasyonu değişiklikleri ile uyumlu olabilir. Şekil 1:. Ex vivo Drosophila Yumurta Aktivasyon Süresi serisinde Tek Ca 2+ Dalga a aşağıdaki UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunaktivasyon tamponu (AH) ve Ayrıca bu yöntem. Sitoplazmik Ca + 2 artış yaklaşık 1.5 mm / sn arasında bir ortalama hız ile arka kutup (B) ve düzende (BF) de kaynaklanır. dalga başlatılması tipik olarak aktivasyon tamponu ilave 3 dakika içinde görülmektedir. Aktivasyondan sonra, olgun yumurta hücre içi kalsiyum seviyeleri seviyeleri (G, H) etkinleştirme öncesi geri döner. tamamlayıcı filmi 1 (toplam süresi 33 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: Aktivasyon Tampon bozan Ca Sitokalasin D ilavesi2+ dalga yayılımı. Ex vivo zaman serileri 10 ug / ml sitokalasin D nihai konsantrasyon (AH) ihtiva eden aktivasyon tamponu ilave edildikten sonra UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunlaşması. Ca 2 + dalga arka kutup (A) başlatılır iken, o tehlikeye ve yumurta (F) anterior bulmuyor (beyaz ok başları dalga ön göstermek). Daha başka Ca 2+ değişiklikleri), 30 dakika boyunca gözlenmiştir. tamamlayıcı filmi 2 (toplam süresi 30 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: E'de Aktin ve Ca 2+ Co-görselleştirmeex vivo Drosophila. Zaman serisinde gg Aktivasyon UASt- myrGCaMP5 (Mavi) ve UASP -F-Tractin.tdTomato (Eflatun) aktivasyon tamponu aşağıdaki ek (AH) ifade Drosophila yumurta olgun. Ca 2 + dalga arka kutup başlatır ve Şekil olarak kurtarır 1. Aktin, beyaz ok ucu (H vs A) zamanla değişiyor gibi görünüyor. Olgun yumurta merkezinde Ca 2 + sinyal tespiti olmaması görüntü yakalama sırasında numunenin hareketine bağlıdır. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.

Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca²⁺ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.

Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.

This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited ¹³, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.

There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca²⁺ wave in mutant backgrounds ^14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca²⁺ wave.

Materials

Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
		Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80mm x 25mm