Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei sığır insan Afrika trypanosomasis ve nagana neden olan bir protozoon bir parazittir. T. brucei nedeniyle yüksek kaliteli genomu, çok sayıda proteomik ve transkriptomiks veri setleri ve iyi gelişmiş moleküler araçlar 1-3 kombinasyonu protein fonksiyonunun analizi için ideal bir organizmadır. Proteomik ve sıralama gelişmeler potansiyel olarak ilginç genlerin 4-6 vurgulamak büyük veri kümelerinde sonuçlandı; Ancak, pek çok gen mevcut veritabanlarında kendileriyle ilişkili çok az bilgi var. Protein fonksiyonel karakterizasyonu yardım etmek için yüksek verimli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır.
etiketli bir proteinin ifade bir proteinin fonksiyonundan içine anlayışlar çokluğu verebilir. Örneğin, bir flüoresan protein veya epitopu ile etiketlenmiş bir proteini PROT hakkında bilgi verir floresan mikroskobu ile lokalize edilebilirEin biyolojik etkisini uygularken olabilir. Seçenek olarak ise, bir musluk 7 ile etiketlenmiş bir protein, HaloTag 8 veya His etiketi biyokimyasal tahlillerde ve etkileşimi ortaklarının tespiti için arıtılabilir.
Biz son zamanlarda T. için sağlam bir etiketleme yöntemi geliştirmiştir brucei 9. Bu transfeksiyon için DNA oluşturmak için uzun astar PCR kullanılan ve paralel proteinlerin onlarca etiketleme izin – Mevcut protokollerine büyük bir gelişme. Biz şimdi bir büyüklük sırasına göre procyclic formlarda bu protokolün ölçeklenebilirlik düzeldi. Burada biz, 24 yuvalı plakalar içinde meydana gelen geri kazanım ve seçim ile 96 gözlü plakalara PCR ve transfeksiyon gerçekleştirmek eden bir yöntem sunulmaktadır. Proteinlerin yüzlerce artık paralel olarak etiketlenmiş üzere bu yöntem tüm tripanozom genomunu etiketleme için bir maliyet-etkin ve uygulanabilir bir yöntem sağlar.
Son 5-10 yıl içinde proteomik ve transkriptomik yöntemlerinin duyarlılığı dramatik gelişmeler genler ve bunların ürünlerinin binlerce değerli veriler sağlamıştır. Ancak, araçlar bu proteinlerin fonksiyonu ayak uyduramadı adresi.
Bir protein etiketlenmesi işlevini belirlemek için çok sayıda deney kolaylaştırır. Örneğin, bir protein lokalizasyonu ve ko-lokalizasyon çalışmaları kolaylaştırmak için farklı renklerin çeşitli bir floresan protein kaynaştırılabilir. Etiketler Böyle APEX2 veya miniSOG 11,12 olarak elektron mikroskobu, için geliştirilmiş, etiketli protein ultrastrüktürel lokalizasyonu izin verir. Böyle TAP etiketi ve ProtC-TEV-Prota (PTP) olarak biyokimya için Etiketler 7,13 bağlayıcı ortakların belirlenmesi için ya da in vitro biyokimyasal tayinlerde protein ile ilişkili komplekslerin saflaştırma izin etiketleyin.
protoc başarısı için kritik olan belirli adımlarPCR Master Mix 1'e DMSO eklenmesi Master Mix 2 Master Mix 2 ticari polimeraz kullanımı ve cytomix elektroporasyon tamponu modifikasyon ilavesinden önce PCR Master Mix 1 dondurma: ol vardır. Deneyimlerimize göre, pozitif olan kaynaklar benzer bir oranını elde etmek için N-terminal etiketleme Transfeksiyonlar için de C ucu etiketleme Transfeksiyonlar için hücreleri iki kat kullanmak gereklidir. tarif edildiği gibi nedenle, tüm adımları yapılmalıdır.
Bu teknik böcek procyclic formu tripanosom transfecting zaman başarılı olmak için sadece muhtemeldir. Kan akımı formları ayrıca onlar yüzünden seçici ilaç ilgisi yoktur yoğunluk bağımlı toksisite seçimi sırasında ölme olasılığı, düşük transfeksiyon verimi 14 var. Bu nedenle, önceki protokol kan formu tripanozomlann 9 etiketleme için mevcut en iyi teknolojiyi temsil eder. Ayrıca, trans-olasıdırFection verimlilik belirli bir tripanosom izolatı bağlı olarak değişecektir. Diğer türler ek optimizasyon gerektirebilir – Bu protokol 927 SMOX procyclic formları kullanarak optimize edilmiştir. başarı olasılığını arttırabilir tedbirler şunlardır: PCR amplikonu miktarını artırarak transfeksiyon dahil edilen hücre sayısı artmaktadır.
Biz proteinlerin yüzlerce paralel olarak etiketlenmiş edilebilecek bir yöntem mevcut. Bu mevcut büyük veri setlerini tamamlayıcı ve topluma çok değerli bilgiler veren, yerelleştirme ve etkileşimi büyük ölçekli çalışmaları kolaylaştıracaktır. Primer şablonları istek ve plazmidler şablonlar listesinde üzerine mevcuttur edinilebilir: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |