Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique
Summary
Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.
Abstract
Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer à long terme de co-culture de plusieurs espèces microbiome intestinal humain avec villosités intestinales microengineered dans un dispositif humain gut-on-a-chip microphysiological. Nous récapitulons l'interface tissu intestinal lumen-capillaires dans un dispositif microfluidique, où des déformations mécaniques physiologiques et des flux de cisaillement de fluide sont constamment appliquées pour imiter le péristaltisme. Dans le microcanal de la lumière, l'épithélium intestinal Caco-2 sont cultivées des cellules humaines pour former un épithélium villosités 'exempt de germes »et régénérer villosités intestinales. les cellules microbiennes cultivées sont pré-inoculées dans le côté de la lumière pour établir un écosystème microbe hôte. Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités, l'écoulement du fluide et des déformations mécaniques sont repris pour produire un microenvironnement état d'équilibre dans lequel le milieu de culture frais est constamment fourni et les bactéries non liées (ainsi que les déchets bactériens) sont continuellement retirés. Après prolongée co-culture fjour de ROM vers semaines, plusieurs microcolonies sont trouvés être situés de façon aléatoire entre les villosités et les deux microbes et les cellules épithéliales restent viables et fonctionnelles pendant au moins une semaine de culture. Notre protocole de co-culture peut être adapté pour fournir une plate – forme polyvalente pour d' autres écosystèmes d'accueil-microbiome qui peuvent être trouvés dans divers organes humains, qui peuvent faciliter étude in vitro du rôle du microbiome humain dans l' orchestration de la santé et de la maladie.
Introduction
L'intestin humain héberge un réseau incroyablement diversifié d'espèces microbiennes (<1.000 espèces) et un très grand nombre de cellules microbiennes (10 fois plus que les cellules hôtes humaines) et des gènes (100 fois plus que le génome humain) 1. Ces microbiomes humains jouent un rôle clé dans le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques, la régulation des réponses immunitaires, et le maintien de l' homéostasie intestinale 2. Sans surprise, compte tenu de ces diverses fonctions, l'intestin microbiome commensal modulant largement la santé et de la maladie 3. Ainsi, la compréhension du rôle des interactions gut microbiome et hôte-microbe sont d' une grande importance pour promouvoir gastro – intestinal (GI) la santé et explorer de nouvelles thérapies pour les troubles intestinaux 4. Cependant, existant dans les modèles in vitro de l' intestin (par exemple, les cultures statiques) limitent la co-culture de l' hôte microbiome à une courte période de temps (<1 jour) parce que les cellules microbiennes et supplantent compromettent la barrière intestinalefonction 5. Modèles animaux de substitution (par exemple, 6 ou génétiquement exempt de germes de souris 7) sont également pas couramment utilisées pour étudier l' hôte-gut microbiome diaphonie parce que la colonisation et l' entretien stable de microbiome intestin humain sont difficiles.
Pour relever ces défis, nous avons récemment développé un humain biomimétique "Gut-on-a-Chip" système microphysiological (figure 1A, gauche) pour émuler les interactions microbiome hôte intestin qui se produisent dans l'intestin humain vivant 5,8. Microdispositif intestin sur une puce comporte deux canaux microfluidiques parallèles séparés par une poreuse, une matrice extracellulaire souple (ECM) de membrane revêtu de bordée par épithéliales intestinales humaines Caco-2 cellules, mimant l'interface tissu intestinal lumière capillaire (figure 1A , à droite) 9. déformations rythmiques cycliques entraînée sous vide induisent des déformations mécaniques physiologiques qui imitent les changements normalement induced par péristaltisme (figure 1A, à droite). Fait intéressant, lorsque cellules Caco-2 sont cultivées dans le tube digestif-on-a-chip pendant plus de 100 heures, ils forment spontanément en trois dimensions (3D) villosités intestinales avec des jonctions serrées, les bordures en brosse apicale, les cellules proliférantes limitées à cryptes de base, la production de mucus, augmentation de l' activité médicamenteuse de métabolisation (par exemple, le cytochrome P450 3A4, CYP 3A4), et le glucose amélioré recapture 8. Dans ce microenvironnement 'exempt de germes », il était possible de co-culture de la GG Lactobacillus rhamnosus probiotique ou une formation thérapeutique d'un mélange bactérien probiotique avec des cellules épithéliales hôte jusqu'à deux semaines 5,10.
Dans cette étude, nous décrivons le protocole détaillé pour effectuer hôte-gut microbiome co-culture dans le dispositif gut-on-a-chip pour une période prolongée. En outre, nous discutons des questions critiques et les défis potentiels à prendre en considération pour une large application de cet hôte-microbiome co-culture protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre les interactions hôte-microbiome est essentiel pour faire avancer la médecine; Cependant, les modèles de culture de cellules traditionnelles réalisées dans une boîte en plastique ou une plaque de puits statique ne prennent pas en charge la co-culture stable de cellules intestinales humaines avec des microbes de l' intestin vivant pendant plus de 1-2 jours parce que les cellules microbiennes envahissent la plupart des cellules de mammifères in vitro. La population microbienne overgrowing co…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
Referências
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