Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para a criação de experimentos competitivos de transplante de medula óssea de camundongos para estudar a função das células-tronco/progenitoras hematopoiéticas sem purificação prévia de células-tronco por classificação de células.
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Artigo de método
Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell
Neste artigo
Resumo
Resumo
A definição padrão-ouro de uma célula-tronco hematopoiética (HSC) é uma célula que, quando transferida para um receptor irradiado, terá a capacidade de restabelecer a produção de células sanguíneas durante a vida útil do receptor. Este protocolo explica como configurar um ensaio funcional para comparar as capacidades de HSC de duas populações diferentes de células, como medula óssea de camundongos de dois genótipos diferentes, e como analisar os camundongos receptores por citometria de fluxo. O protocolo usa equivalentes HSC em vez de classificação de células para padronização e discute as vantagens e desvantagens de ambas as abordagens. Além disso, discutimos diferentes variações do protocolo básico, incluindo transplantes em série, ensaios de diluição limitante, ensaios de homing e transplantes não competitivos, incluindo as vantagens e usos preferidos dessas abordagens variadas. Esses ensaios são centrais para o estudo da função do HSC e podem ser usados não apenas para a investigação de aspectos intrínsecos fundamentais do HSC da biologia, mas também para o desenvolvimento de ensaios pré-clínicos para transplante de medula óssea e expansão do HSC em cultura.
Introdução
A hematopoiese é um processo regenerativo que garante o reabastecimento das células do sangue que foram perdidos devido a uma lesão, a radiação e a morte celular. Este processo é assegurada por células estaminais hematopoiéticas (HSC), que em grande parte residem na medula óssea de adultos. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas podem ser utilizados para fins terapêuticos em doenças auto-imunes, doenças malignas hematológicas e imunodeficiências 1. Assim, há uma necessidade de compreender melhor os mecanismos que regulam a função HSC, incluindo sua expansão proliferativa e sua capacidade de alcançar e enxertar a medula óssea receptor após o transplante. Embora estudos recentes tenham relatado vários marcadores de superfície celular, incluindo os membros da família SLAM CD150 e CD48, para enriquecer prospectivamente HSCs adultos e fetais HSCs para aproximadamente 50% de pureza 2-4, a medida padrão de ouro para hsc funcional permanece um ensaio in vivo para repovoar determinar a sua capacidade de restabelecer sangue cprodução ell em um host irradiado 5.
O ensaio de repovoamento clonal in vivo foi inicialmente desenvolvido por Till e McCulloch 6 e desde então tem sido aperfeiçoado e expandido. Tal como inicialmente definido, HSCs garantir a produção de glóbulos ao longo da vida através da auto-renovação e diferenciação. A transferência de HSCs para um destinatário irradiado permite-nos assim a avaliar: a sua capacidade de se diferenciar por meio da análise das diferentes linhagens de células sanguíneas (linfócitos T, linfócitos B, granulócitos, monócitos) e a sua capacidade de auto-renovação por transplante em série. O ensaio que geralmente envolvem a comparação da funcionalidade e / ou a quantidade de duas populações de HSCs, por exemplo, células provenientes de dois ratinhos de diferentes genótipos ou células que foram tratadas ou não tratadas com diferentes factores que podem influenciar a manutenção ou expansão de HSCs em cultura. quimerismo doador, ou a contribuição de doadores transferidos HSCs tO produção de células sanguíneas pode ser então determinada por análise de citometria de fluxo no sangue periférico e de medula óssea por meio de marcadores de superfície celular ou outros métodos que irão distinguir células dadoras do recipiente, ou hospedeiro. Os marcadores mais utilizados são certamente os dois alelos para o gene Ptprc ou antígeno CD45 leucócitos 7 que temos escolhido para os exemplos fornecidos abaixo.
O ensaio de repovoamento clonal pode ser competitiva ou não competitiva. Em uma configuração não-competitivo, de controlo e de teste HSCs são transferidos para ratinhos receptores separados e os resultados para cada tipo de célula será independente da outra. Num ambiente competitivo, a função tanto de teste e de controlo HSCs é medido contra uma população de HSCs concorrente. O protocolo descrito aqui usa a configuração competitiva, mas também pode ser adaptado para situações não-competitivas. Ambas as abordagens têm suas vantagens e limitações, e vamos compará-las em detalhe nodiscussão. Nós também descrevem abordagens diferentes para garantir a equidade no número de HSCs transplantadas, explicam como adaptar o ensaio para a quantificação de HSCs, limitando ensaio de diluição (LDA), e fornecer exemplos de ambos os transplantes de bem e mal sucedidas para a interpretação dos resultados.
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Protocolo
Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pelo comitê de ética animal institucional e seguir o Canadian Council on Animal Care orientações.
Nota: Para manter condições estéreis / ou específicas isentos de agentes patogénicos de habitação, realizar todos os procedimentos que envolvem a manipulação direta de ratos vivos dentro de uma cabine de segurança biológica ou uma capela de fluxo laminar. Limpe ou esterilizar gaiolas, dispositivos de retenção, materiais de construção, comida e água fornecida aos animais de forma adequada. Use, agulhas descartáveis única estéreis para as injeções e para coleta de sangue. A técnica asséptica é crucial durante a preparação do enxerto.
1. Preparação de ratinhos receptores
- Identificar ratos receptores com entalhes de ouvido (ou outro método aprovado pelo Comitê Local ética animal 8) para permitir indivíduo acompanhamento da reconstituição sangue e medula óssea periférica ao longo do tempo. Pesa-se a ratinhos para pós-transplante de seguimento. Noscamundongos destinatário E que estão entre 7 e 12 semanas de idade (menos de 25 g).
Nota: No exemplo fornecido, ratos destinatário CD45.1 + CD45.2 + foram criados em casa, atravessando camundongos C57BL / 6 com ratos B6.SJL cong�icas. - Irradiar ratinhos receptores com duas doses de 450 rad para destruir a actividade hematopoiética. Submeter a primeira dose no dia antes do transplante e a segunda 1-2 h antes do transplante.
Nota: raio-x ou raios gama podem ser usados, dependendo da disponibilidade de instalações adequadas.
2. Preparação de doadores e Concorrente Células da Medula Óssea
- Eutanásia doador (teste e controle; CD45.2 +) e competidor (CD45.1 +; B6.SJL) ratos por asfixia com CO2, seguido por deslocamento cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
- Coloque os ratos em suas costas, pernas abertos, em uma placa de Petri vazia ou em uma gaze estéril (para manter a superfície de trabalho limpa) inside uma cabine de segurança biológica. Molhar a pele e a pele com 70% de etanol / 30% de H2O (v / v).
- Cortar o pé com uma lâmina cirúrgica ou tesoura afiada. Cortar abrir a pele ao longo da perna e afastar a pele com pinças serrilhadas. Cortar o excesso muscular.
- Deslocar fémur puxando pelo osso da perna e usando lâminas de tesoura contra os ossos pélvicos como uma força contrária. Retire tíbia e fêmur da rótula e remover pedaços restantes de músculos e tendões. Colocar os ossos em 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) numa placa de cultura de tecidos de 6 poços.
- Recolha células da medula óssea por rubor os ossos com 5 ml estéril PBS.
- Segurar o osso suavemente com uma pinça e inserir uma agulha de 25 G ligada a uma seringa cheia de 1 ml para uma extremidade do osso. Pressionar o êmbolo e recolher as células em um tubo de 15 ml. Repita conforme necessário até que o centro do osso é branco.
- Dissociar as células por repetidas que passa através da agulhase obter uma suspensão de célula única. Evite bolhas e força em excesso. Nota: Use uma agulha ligeiramente maior (22 L) para melhorar a viabilidade das células nesta etapa.
- Passar as células através de um filtro de nylon de 70 ^ m a assegurar a suspensão de células uniforme e para remover detritos e aglomerados.
- Remove-se uma alíquota para contagem de células utilizando um hemocitómetro. Centrifugar a suspensão de células remanescente em 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Reajustar a densidade celular como exigido em PBS estéril (10 8 células / ml). Manter as células no gelo.
3. Estabelecer doador da célula Equivalentes HSC
- Transferir o equivalente a 3 x 10 6 células (30 uL) em 5 ml de um tubo redondo de poliestireno de fundo para a coloração de citometria de fluxo. Adicionar um volume igual de anticorpo não marcado contra CD16 / CD32 para bloquear a coloração não específica (diluído em tampão de coloração (PBS suplementado com albumina de 0,1% de soro de bovino (BSA) e EDTA 1 mM) para uma concentração final de 2,5 ug / ml). Incubar 5 min à TA.
- Adicionar 90 ul conjugado com fluorocromo anticorpo mistura principal preparada em tampão de coloração: cocktail Lineage biotinilado (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incubar em gelo durante 30 minutos, ao abrigo da luz.
Nota: as diluições apropriadas devem ser determinadas para cada lote de anticorpo. Veja a Tabela de Materiais para diluições utilizadas neste estudo. - Adicionar 2 ml de tampão de coloração para as células, de vórtice e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para remover o anticorpo não ligado. Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito.
- Adicionar 10 ul de estreptavidina conjugado com fluorocromo diluído em tampão de coloração (ver Materiais Tabela). Incubar em gelo durante 20 minutos, ao abrigo da luz. Lavar como no passo 3.3 para remover estreptavidina não ligado.
- Adquirir as amostras de células, utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, seis detectores 9. Determinar a frequência de Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + (avaliado HSCs) em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentado na Figura 2 e conforme relatado anteriormente 10,11.
Nota: A frequência de HSCs funcionais dentro dessa população pode ser estimado entre 1/3 e 1/5 2,12. - Estabelecer equivalentes HSC estimados para todas as amostras 11, usando uma amostra (tipicamente, o competidor, B6.SJL CD45.1 +, neste exemplo) como linha de base, como detalhado a seguir e na Figura 2.
- Calcule o número de células necessárias utilizando as seguintes fórmulas:
#transplanted HSCs / destinatário = 5 x 10 5 células x estimado frequência HSC (conforme determinado para a amostra de linha de base; este número é geralmente entre 75 e 125 para o tipo selvagem camundongos C57BL / 6) 10-12.
Nota: Na figura 2, a amostra A, o resultado é de 139 HSCs.
# células transplantadas no total (para outras amostras, por exemplo Amostra B na Figura 2) = # transplantados frequência HSCs / HSC.
Nota: Na figura 2, para a Amostra B, o resultado é 197.826 (ou seja, aproximadamente 2 x 10 5) total de células de medula óssea.
- Calcule o número de células necessárias utilizando as seguintes fórmulas:
- Calcular o número total de células necessárias para cada receptor do enxerto para cada amostra, utilizando os resultados obtidos acima.
Nota: Este número deve ser de 5 x 10 5 para a amostra de referência (concorrente).- Multiplicar o número obtido na etapa 3.7 pelo número de ratinhos receptores e adicionar células suficientes para, pelo menos, dois ratinhos adicionais para compensar o volume morto na seringa.
- Misture competidor (por exemplo, CD45.1 +) e células de teste (CD45.2 +) em 1: 1 razão equivalente HSC como calculado no passo 3.6 e ajustar o volume final para 200 mL por injecção utilizando PBS estéril.
Nota: Para um grupo de cinco ratinhos receptores do volume sugerido seria, assim, pelo menos, 1,4 ml, contendo 3,5 x 10 6 concorrente células de medula óssea (ou973 HSCs estimados a amostra A na Figura 2), e o número equivalente de células de teste (na Figura 2, o equivalente para a Amostra B seria 197826 x 7 = 1,384,782 células de medula óssea).
4. Transplante de Medula Óssea
- Aquecer os ratinhos receptores irradiados na etapa 1.2, com uma lâmpada de calor vermelho para assegurar a dilatação dos vasos sanguíneos e para fazer a lateral da cauda veias mais visível.
- Prepara-se uma seringa de 1 ml de tuberculina equipadas com uma agulha G 27 (ou menor). Aspirar cerca de 750 ul da suspensão de células preparada (para ratinhos receptores 3). Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa.
- Insira o mouse em um dispositivo de retenção. Examinar a cauda e olhar para as veias da cauda laterais que devem ser claramente visíveis em ambos os lados da cauda. Limpe o local da injecção com etanol. Inserir a agulha bisel para cima, paralelo à pele e pressione suavemente o êmbolo. A injecção deve ser fácil. Se a força é recessário, a agulha não está na veia.
Nota: os ratos mais velhos têm pele mais espessa, o que pode fazer encontrar a veia mais difícil. Se a agulha não está na veia, reinserir a agulha proximal do local da injecção inicial. - Remover a agulha e pressione o local de injecção com gaze esterilizada durante alguns segundos para parar a hemorragia. Transferir o mouse em uma gaiola limpa.
Nota: Use a mesma seringa e agulha por três injeções, após o que a agulha pode se tornar muito maçante. - Para pós-transplante follow-up, injectar 1 ml estéril PBS subcutaneamente para reidratar os ratos durante os primeiros cinco dias. Adicione antibióticos em água potável para prevenir infecções (se necessário; opcional). Pesar ratos a cada dois a três dias para as três primeiras semanas e eutanásia ratos que perderam mais de 15-20% do peso corporal pré-transplante (ou conforme determinado pela comissão de ética animal local).
5. Análise de sangue periférico
- Coletar uma gota de sangue (approx. 50-100 ul) em tubos de EDTA.
- Para colheita de sangue a partir da veia da mandíbula, usar uma lanceta ou uma agulha de 22 G para perfurar a pele facial perto do local sem pêlos localizado sob o osso maxilar e colocar o tubo de recolha para receber a gota de sangue 13. Recolha de sangue em 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante para seguir multi-linhagem reconstituição.
- Adicionar 1 mL preparado de fresco RT tampão de lise de glóbulos vermelhos (9 partes de 0,16 M NH 4 Cl + 1 parte de Tris-HCl a pH 0,17 7,65) para a gota de sangue recolhidas no passo 5.1.1. Misture e amostra de transferência para a 5 ml tubo de poliestireno de fundo redondo adequado para citometria de fluxo. Deixar repousar durante 4 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 volumes de PBS gelado. Misture girando end-to-end e transferir imediatamente em gelo. Centrifugar 10 min a 200 xg, a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito. Sobrenadante deve ser claro e vermelho. Adicione 2 ml de coloração de buffer e vortex brevemente. Centrifugar 5 min a 200 xgat 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito.
- Proceda com citometria de fluxo coloração utilizando o protocolo geral descrito nos passos 3.1 a 3.3 e os seguintes anticorpos para a mistura principal: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
- Adquirir as amostras de células, utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, seis detectores 9. Determinar a frequência de células derivadas do dador para cada linhagem (linfócitos B CD19 +, de linfócitos CD3e + T, granulócitos GR1 brilhantes) em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentada na Figura 3 e como publicado 10,11.
6. Análise de Medula Óssea A reconstituição
- Recolha células da medula óssea, conforme detalhado na seção 2. Stain as células para análise de citometria de fluxo utilizando o protocolo geral descrito nos passos 3.1 a 3.3 e os seguintes anticorpos para a mistura principal: cocktail Lineage, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. detectar linanticorpos cocktail EAGE utilizando estreptavidina conjugada com fluorocromo como descrito na etapa 3.4.
- Adquirir amostras de células utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, oito detectores 9. Se apenas seis estão disponíveis, adicionar CD135 para o mesmo canal como o painel de linhagem de células CD135 + serão excluídos. Determinar a frequência de Lin derivadas do dador - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSC em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentada na Figura 4 e como publicado a 10.
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Resultados
Uma descrição geral da definição de transplante competitivo, incluindo transplantes secundárias (discutido mais adiante) pode ser encontrada na Figura 1. A análise representativa de medula pré-transplante ósseo HSCs pode ser encontrada na Figura 2. Informações mais detalhadas sobre a exclusão de dobletes e células mortas pode ser encontrada em outros lugares 9.
As Figuras 3<...
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Discussão
O protocolo aqui descrito destina-se a avaliar a aptidão relativa de dadores (teste) HSCs contra competidor conhecido HSCs. A situação de concorrência aumenta a sensibilidade relativa do ensaio (maior probabilidade de detectar reduções moderadas na aptidão de células-tronco) e fornece um controle técnico interno para a eficácia da irradiação e injeção. No entanto, ele não deve ser utilizado como uma medida absoluta de HSC aptidão; uma diminuição na reconstituição competitivo não significa automaticamente que o HSCs não ...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos a Roxann Hétu-Arbour para a assistência com o design figura e demonstração dos procedimentos. Pesquisa no laboratório foi apoiado por uma concessão de Transição da Fundação Cole, Descoberta conceder nenhuma. 419226-2012 das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para a Inovação (CFI Líderes Fundo conceder no. 31377). KMH é um Chercheur-Boursier Júnior para o Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Microtainer com K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| Seringa | 20 G | Para amostragem de sangue da veia mandibular | |
| LabQuake Shaker rotisserie Thermo | Scientific | C415110 | |
| Purificado anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μ g / ml |
| CD3e anti-camundongo conjugado com Pe-Cy7 (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0,25 μ g/ml |
| camundongo conjugado com PE anti-camundongo CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0,25 μ g / ml |
| APC-eFluor780 (equivalente a APC-Cy7) - conjugado anti-camundongo GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0,25 μ g / ml |
| conjugado FITC anti-camundongo CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μ g / ml |
| eFluor450-conjugado anti-camundongo CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1,00 μ g / ml |
| Biotinilado anti-humano / camundongo CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilated anti-mouse CD11b (clone M1 / 70) | eBioscience | 13-0112 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilado anti-rato GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinilado anti-rato TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0,625 μ g / ml |
| V500 estreptavidina | BD Biosciences | 56149 | 0,5 μ g/ml |
| camundongo conjugado com PE CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0,25 μ g / ml |
| camundongo conjugado com PE-Cy7 Ly6A / E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0,25 μ g / ml |
| PerCP-eFluor710-conjugado anti-camundongo CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0,5 μ g / ml |
| Alexa fluor 647-conjugado anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0,625 μ g/ml A BD Biosciences e a eBioscience não carregam o mesmo clone |
| Seringa de tuberculina de 1 ml com agulha de 27 G | Seringa BD | 309623 | |
| Seringa de tuberculina de 1 ml com agulha de 25 G | Seringa BD | 309626 | |
| 70 μ filtro de células m | BD Falcon | 352350 |
Referências
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Reimpressões e permissões
