This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
Multipel skleros (MS) kännetecknas av inflammatoriska lesioner, främst vita substans regioner i hjärnan tidigt i sjukdomen. Efter långvarig progression, är grå substans atrofi detekteras genom MRI imaging och markerar den neurodegenerativa fasen av sjukdomen. Reaktiv glios, demyelinering och axonal skada i den vita substansen tillskrivs CNS-infiltrerande immunceller. Ingen av de behandlingar som för närvarande används i MS bakåt eller direkt förhindra neurodegeneration i CNS – i stället, de minskar inflammation genom att dämpa T-cellsaktivering och / eller infiltration i CNS. Eftersom det inte finns något botemedel för MS och patienter som använder nuvarande behandlingar fortsätter att uppleva sjukdomsprogression, upptäckter av läkemedel som förhindrar demyelinisering och neuronal förlust är av avgörande betydelse. Däremot kan skilja mellan effekter på immunceller och de på CNS vara svårt experimentellt, eftersom resultatet – det vill säga, minskad skada på CNS – ser same oavsett de mekanismer genom vilka det förekommer. Därför måste bedömningen av CNS skydd samarbetar med bedömningar av CNS-infiltrerande immunceller och förökning av immunceller i periferin för att avgöra hur farmakologiska medel påverkar sjukdomsmekanismer.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en väletablerad djurmodell av autoimmuna inflammatoriska sjukdomar som var direkt ansvarig för upptäckten av läkemedel som för närvarande används för behandling av MS 1-4. Möss används ofta för EAE, med C57BL / 6-möss är en populär stam baserat på tillgängligheten av genetiska varianter. C57BL / 6-möss inducerade med EAE uppvisar kronisk sjukdomsprogression med uppkomsten runt dag 10 efter induktion. Infiltration av ryggmärgen parenkymet och lillhjärnan är kännetecknande för histopatologi av dessa djur, med frånvaro av infiltration i kortikala parenkymet 5. Dessutom, kortikala lesioner och demyelinisering i bregn är kännetecken på sjukdomen 6-9, som är relativt frånvarande i C57BL / 6 möss. Därför kan det vara att föredra när det är möjligt att använda SJL-möss, som har skovvis förlöpande sjukdom och skador som finns i både hjärnan och ryggmärgen som visas liknar dem i MS 10.
Behandlingen kan inte klassificeras som neuroprotektiva om immunceller når aldrig CNS. Därför utgör denna protokoll användning av flödescytometrisk analys av hjärnor, ryggmärg, och mjältar från EAE-möss för att bestämma effekten av behandling på immuncellinfiltration i CNS och proliferation av immunceller i periferin, såsom tidigare visats 11. Immunohistokemiska analyser av CNS-vävnad för att bestämma omfattningen och arten av neuroprotektion beskrivs också. Genom att kombinera dessa metoder gör det möjligt att avgöra huruvida immunceller aktiverades och frodats i periferin, om immunceller in i CNS, och huruvida CNS var protected från inflammation eller skada. Om neuroprotektiva effekter misstänks trots effekter på immunsystemet, kan praktiker ändra behandlingen starttider efter immunceller infiltration i CNS har inträffat.
Här presenterar vi ett protokoll med hjälp av två olika modeller av aktiv EAE, en cellmedierad djurmodell T MS, och flödescytometrianalys kombination med immunohistokemi vid olika tidpunkter under sjukdomen för att fastställa effekten av experimentella behandlingar på olika aspekter av MS patogenes. Denna metod kommer att hjälpa forskare att skilja mellan effekter på immuncelltillväxt och infiltration mot CNS skydd, vilket gör det lättare att begränsa hur läkemedel verkar på sjukdoms patogenes.
Patienter med MS fortsätter att uppleva sjukdom återfall samtidigt som läkemedel som dämpar T-cellaktivering och / eller infiltration i CNS, motiverar utvecklingen av behandlingsalternativ som direkt skyddar CNS. EAE har klassiskt använts för att modellera symtomen vid MS och kan vara ett kraftfullt verktyg när man studerar vilken typ av interaktion mellan immunsystemet och CNS in vivo. Använda tidpunkten för behandling överväganden i EAE, t.ex., före eller efter initiering av sjukdom, i samband med att undersöka immuncellinfiltration i CNS och spridning och aktivering i periferin, är det möjligt att beskriva effekterna av behandlingar på både immunförsvaret och CNS.
Medan EAE i C57BL / 6 mus är mer allmänt används, kan EAE i SJL musen vara mer representativ för de flesta MS-fall, eftersom dessa möss har en skovvis förlöpande fenotyp och infiltration av immunceller i parenkymetav hjärnan 10. SJL-möss har tydlig återhämtning under remission också, vilket gör det möjligt att påbörja behandling efter det att sjukdomen har presenterat men under tider av minskad inflammation. Det är viktigt att tänka på att SJL möss inte alltid återfall och återför synkront, vilket resulterar i potentiellt stora variationer när resultaten slås samman. Därför kan vissa forskare välja att visa representativa resultat för kliniska poäng från ett djur samtidigt som möss för FACS-analys och histologi på individuella punkter i sjukdomsförloppet.
Överväga när manipulationer görs till EAE-möss kan hjälpa till vid bestämningen av hur en behandling påverkar immunsystemet eller CNS. Det finns många alternativ för när behandlingen påbörjas, var och en med sin egen klang för om immunceller har kommit in i CNS och hur de kan interagera med CNS. Behandling före symtomdebuten innebär att immunceller ännu inte har trätt eller orsakat skada på CNS.Behandling efter symtomdebut innebär att immunceller har kommit in i CNS och har orsakat en del skador. Med hjälp av SJL-möss, kan behandlingen också påbörjas under ett återfall, där immunceller aktivt infiltrera och orsakar inflammation, eller under remission, där immunceller kan vara mindre utbredd i CNS med mindre inflammation. Inledande hypoteser om hur behandlingar påverkar CNS och immunsystemet kan göras när man överväger där immunceller är i den patologiska processen under behandlingen.
Det finns ett antal sätt på vilka behandlingar kan påverka immunceller och CNS, var och en med slutresultatet att minska svårighetsgraden av EAE-symptom. Därför är det nödvändigt att använda flödescytometrisk analys och immunohistokemi för att titta på hur immunceller påverkas i periferin och CNS, om immunceller har kommit in i CNS, och hur CNS reagerar på behandlingen. Medan flödescytometrisk analys av ryggmärgen kan bestämma hur många celler have in CNS vid en given tidpunkt, kan man inte bestämma att denna effekt beror på minskad immunceller människohandel inte proliferation av immunceller är opåverkad i mjälten. Det är därför nödvändigt att analysera både perifera och CNS-vävnad och avgöra vad resultaten betyder mekanistiskt när båda vävnader jämförs. Det är också möjligt för immuncellaktivitetsprofiler som skall förändras genom behandling, exempelvis med en omkopplare i en patogen hjälpar-T-cell-tung-profil till en reglerande T-cell-tung-profil. Om man tittar på markörer för olika celltyper och jämföra procent uttryck mellan behandlade och obehandlade djur är därför också en viktig faktor. En framväxande koncept i MS forskning tyder på att B-celler spelar en viktig roll vid autoimmun demyelinisering. Detta grundar sig på studier som visar att B-celler är nödvändiga för reaktivering av T-celler 20. Detta koncept stöds av framgången av behandlingar såsom rituximab, en antikropp mot CD20 extrycks på ytan av B-celler 21,22. Som framgår av framgången med den monoklonala antikroppen ocrelizumab i kliniska prövningar kan läkemedel inriktade på olika epitoper av CD20 förbättra effektiviteten av B-cell-riktade läkemedel 23.
En begränsning av de tekniker som presenteras här är att det är möjligt för immunceller att komma in i centrala nervsystemet men var oförmögen att resa i parenkymet. Immunohistokemi kan användas för att detektera perivaskulär ansamling av inflammatoriska celler av immunceller och utvärdera tillryggalagda sträckan i parenkymet mellan behandlade och obehandlade djur. En annan potentiell begränsning innebär effekterna av microbiome på EAE patogenes. Kommentarmfloran kan kraftigt påverka sjukdomen patogenes 24; Därför, möss inrymt i olika kolonier och även i olika burar kan ha stora skillnader i sjukdomens svårighetsgrad. Följaktligen är det alltid att föredra när det är möjligt att använda kull kontroller som tas upp i samma bur förexperiment med EAE. En sista anmärkning är att om det är experimentellt önskvärt att eliminera effekterna av immun cellproliferativa förändringar i periferin, kan det vara möjligt att göra det med hjälp av passiv överföring induktion snarare än den aktiva induktions beskrivs i detta protokoll.
Ytterligare bekräftelse för neuroskydd kan åstadkommas med användning av en sam-odlingssystemet 11 för att testa specifika mekanismer för celldöd eller genom användning av villkorliga knockout-möss som möjliggör radering av proteiner selektivt på en celltyp. Vidare att utvidga utforskningen av farmakologiska medel som är neuroprotektiva bör markörer för axonal tran och nervcellsdöd ingå. Ett annat viktigt område är remyelinisering. Skadade axoner inte kan remyelinate utlåning ytterligare stöd som neuroprotektiva terapier bör vara en viktig del av remyelinisering terapier. Dessutom omyeliniserade axoner är mer sårbara för skador än myelinated axoner. Detta tyder på att när en axon blir demyelinerade terapeutiska ingrepp som främjar snabb remyelinisering förhindrar axonal skada. För att undersöka dessa möjligheter, kan andra in vivo-modeller för demyelinering och remyelinisering användas (dvs cuprizone och lysolecitin). Den metod som beskrivs här inriktad på att bedöma neuroprotektion genom att kvantifiera myelin förlust. För utvärderingen av remyelinisering antalet stamceller liksom deras förmåga att föröka sig och mogna skulle också vara viktigt att undersöka. Med omnämnandet av dessa alternativa modeller, måste man också överväga olika modeller av encefalit som viralt förmedlas. Det finns två väl karakteriserade RNA virala modeller som producerar myelin förlust: en är Theiler s mus encefalomyelit, en icke-hölje Picornaviridae virus, och den andra är musen hepatitvirus, en medlem av Coronaviridae virusfamiljen 25,26.
EAE är ett värdefullt verktyg för studies av hur manipulationer eller behandlingar påverka immunsystemet och CNS in vivo. Protokollet som beskrivs här kan hjälpa till att avgöra där behandlingar påverkar sjukdomsprocessen, vare sig det är i periferin, vid blod-hjärnbarriären, eller i CNS. Inga pågående behandlingar för MS bota sjukdomen och patienter ofta upplever nedgång över tiden. På samma sätt, andra sjukdomar som involverar immunceller infiltration i CNS och nedbrytning av myelin, inklusive akut disseminerad encefalomyelit, transversell myelit och neuromyelitis optica, saknar behandlingar som skyddar CNS eftersom det är direkt under attack av infiltrerande immunceller. Med hänsyn till tidpunkten för behandling och användning av flödescytometrisk analys av mjälten och ryggmärgen i samband med immunohistokemi i CNS för att bedöma inflammation och skador kommer att möjliggöra mekanistiska bestäm göras angående behandlingar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, Den Civitan International Research Foundation, Mike L. Jezdimir transversell myelit Foundation, University of Alabama Health Services Foundation – General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, och T32 AI007051 från National Institute of Allergy och Infectious Diseases, National Institutes of Health.
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |