تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

دراسة الأنسجة والأعضاء أو الأنظمة في المختبر هي محاولة لتبسيط العلاقات المعقدة جدا القائمة بين عدة أنواع فرعية الخلوية التي تضم الكائنات متعددة الخلايا. في الواقع، في الدراسات المختبرية تجعل من الممكن الحصول على فهم مفصل للسكان خلية واحدة. هناك نوعان من المزايا الرئيسية لإجراء التجارب في المختبر: 1) انخفاض التفاعلات الخلوية، و2) القدرة على التعامل بسهولة البيئة الخلوية. العلماء ومن هنا، سمحت هذه المزايا اثنين للتنبؤ السلوك من أنواع معينة من الخلايا في الجسم الحي، مما أدى إلى القدرة على تنظيم النتائج من التأثيرات خارجي في الكائنات كلها. في هذا المعنى، في المختبر زراعة الخلايا غالبا ما يعمل كجسر يربط علوم الحياة الأساسية والتطبيقية. ومع ذلك، هناك أيضا العديد من عيوب العمل في المختبر، واحد أهمها أن تحفظ معين قد يسكن في فيزيولوجيآل أهمية الظواهر المرصودة. في الواقع، عندما يزرع نوع خلية واحدة في وعاء، تفقد الثقافة، إلى حد مختلف، وصلات خلية خلية مع أنواع الخلايا الأخرى، ومساهمتها في البيئة السائلة من الأنسجة والكائنات الأصلية، والمراسي داخل النسيج الذي مكنها من التمسك هيكل ثلاثي الأبعاد خاص حاسما في بعض الأحيان من أجل وظيفة الخلية.

وقد تم تناول مسألة العلاقات خلية خلية من خلال تطوير تقنيات زراعة المختلطة. في هذه الطريقة، وتزرع اثنين أو أكثر من السكان الخلية معا في سفينة الثقافة نفسها. ومع ذلك، هذه الثقافات مختلطة تحمل المضايقات الهامة. من جهة، وبعض أنواع فرعية الخلية لا تتفاعل جسديا مع بعضها البعض في الأنسجة المنشأ والاعتماد فقط على الاتصالات نظير الصماوي التي لحقت العوامل القابلة للذوبان يفرز ومستقبلات المجاورة. هذا هو الحال لعدة عمليات الالتهابات التي تعتمد على إشارات خلوى القريبة. في ج مختلطةultures، والتفاعلات المادية التي لا يمكن تجنبها وتجعل من المستحيل لدراسة الاتصالات نظير الصماوي في غياب الاتصالات خلية خلية التي يمكن أن تسفر عن نتائج المتغيرة. من ناحية أخرى، وتحقيق التفسيرات خلايا محددة من داخل الخليط السكاني يصبح غير مجد دون استخدام تقنيات الفصل القاسية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج.

لحل هذه القضايا الهامة، وقد تم تطوير استخدام وسائل الإعلام مشروطة كأسلوب السماح للثقافات مجزأة ودراسة الإشارات نظير الصماوي. يتطلب هذا الأسلوب نقل طاف من نوع خلية واحدة، وبالتالي اسمه مكيفة المتوسطة، إلى الآبار التي تحتوي على مجموعة أخرى من الخلايا. ومع ذلك، ولكن هناك عائقا مهما هو أن جزيئات قصيرة الأجل لا البقاء على قيد الحياة لفترة كافية في المتوسط ​​مكيفة على أن يتم تحويلها إلى آبار السكان الثاني من الخلايا. سيتم حتى جزيئات طويلة العمر تضعف إلى حد كبير مع مرور الوقت بسبب نشرها. وعلاوة على ذلك، سواء خليةالسكان يشارك فقط في مجال الاتصالات نظير الصماوي أحادي الاتجاه وليس في اتصال ثنائي الاتجاه النشط. وهذا يقود إلى عدم وجود إشارات ردود الفعل التي أمر حيوي في إعادة العلاقات متعددة الخلايا دقيقة لأنها موجودة في الجسم الحي.

ونتيجة لذلك وبدافع الحاجة لمحاكاة أفضل الأصلي في ظروف المجراة في المختبر في البيئة الخلوية، وقد تم تحقيق العديد من التطورات في تقنيات زراعة الخلايا على مر السنين. كان واحدا من التقدم الأكثر أهمية استخدام دعامات قابلة للاختراق مع الأغشية الصغيرة التي يسهل اختراقها لcompartmentalizing مزارع الخلايا، وتستخدم لأول مرة من قبل Grobstein في عام 1953 ^1. وقد جرى تصميم هذه الدعامات منفذة على مر السنين لاستيعاب العديد من أنواع الخلايا واستخدامها في العديد من التطبيقات المختلفة. في الوقت الحاضر، وهذه تدعم وجود تدرج كما جوفاء التي تم تصميمها للراحة في الآبار من لوحة زراعة الأنسجة multiwell أو في التعأطباق لار. في نظام الثقافة المشتركة، وإدراج يحتوي على نوع من الخلايا واحدة في حين البئر أو طبق يحتوي على السكان الخلوية الأخرى، مما يسمح لدراسة مساهمة اثنين من مجموعات مختلفة من الخلايا في بيئة الخلطية منها (الشكل 1). ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على الاستقطاب الخلوي (basolateral مقابل إفراز قمي أو استقبال إشارة)، مما يمنح أنظمة إدراج ثقافة مشتركة ميزة مهمة ضد الثقافات المختلطة وتقنيات المتوسطة مكيفة. تتوفر عدة أنواع من المواد غشاء، وأكثرها شيوعا هو البوليستر (PET)، والبولي (PC) أو المغلفة الكولاجين تترافلوروإيثيلين (PTFE)، وكانت موجودة في أحجام المسام مختلفة تتراوح من 0.4 ميكرومتر إلى 12.0 ميكرون. هذه الأصناف من المواد وأحجام المسام تقدم تشكيلة واسعة من إدراج ممارسة ملامح متغيرة ذات الصلة إلى الخصائص البصرية، وسمك الغشاء والالتزام الخلية التي جعلها عملية على مختلف المستويات ليلي يستخدم سبيل المثال لا الحصر:
-studyingتمايز الخلايا، التطور الجنيني، الانبثاث ورم وإصلاح الجرح بواسطة فحوصات chemotaxic من خلال نفاذية الأغشية.
-evaluating تغلغل المخدرات عن طريق تقييم وسائل النقل من خلال الطبقات الوحيدة الظهارية أو البطانية مثقف على دعامات قابلة للاختراق، و.
-إجراء خلية المشترك الثقافات لتحليل التحويرات سلوك الخلايا الناجم عن العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال.

والغرض من هذه المقالة هو وصف المبادئ التوجيهية المنهجية العامة لأداء وظيفة الثالثة المذكورة أعلاه، وهذا هو لتقييم التغيرات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال باستخدام نظام إدراج ثقافة مشتركة. العديد من المجالات المختلفة للبحث الاستفادة من أنظمة إدراج ثقافة مشتركة من أجل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة لتأثير العوامل القابلة للذوبان يفرز على السكان من الخلايا. في الواقع، يشير نظير الصماوي الذي ينظم السلوك الخلوي على مختلف المستويات هي ذات الصلة في جميع الأنسجةوالنظم، مما يجعل الأنظمة شارك في ثقافة إدراج لا غنى عنها لضمان التقدم في هذه المجالات. على العكس من ذلك، استخدام إدراج ان اؤكد ان نقل الإشارة هو عن طريق الاتصال المباشر خلية خلية وليس العوامل يفرز. واحدة من أهم استخدامات تدرج في الدراسات التهاب ^2-14 حيث يتم تقييم تأثير السيتوكينات يفرز في مختلف اللاعبين الخلوي للمناعة. على وجه الخصوص، وقد استفادت الدراسة من التهاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) كثيرا من الدراسات إدراج الثقافة المشتركة، التي سمحت لتحديد أفضل الأدوار نظير الصماوي متميزة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة في القيادة neuroinflammation ^15-21. وقد وضعت هذه الأنظمة أيضا لدراسة إمكانية المضادة للالتهابات من الجزيئات التي تعتمد على قدرتها على تقليل أو منع إفراز العوامل المؤيدة للالتهابات ^22-26. الأبحاث المتعلقة بسرطان ^27-31، ولا سيما الآليات الكامنة وراء الأوعية الدموية ^32-34 وinflammatiعلى ^35-42 في تكون الأورام، يستفيد أيضا من أنظمة إدراج ثقافة مشتركة. وعلاوة على ذلك، والعوامل القابلة للذوبان هي ذات أهمية قصوى في العمليات التي تقود التمايز والعديد من الدراسات قد استخدمت تدرج للإجابة على الأسئلة في هذا المجال بشكل خاص ^43-50. في الجهاز العصبي المركزي، كما نرى الأنسجة العصبية لديها امكانات تجديد محدودة للغاية، ودراسة neurotrophism والعصبية هي الأساسية، وقد ضمنت على نطاق واسع عن طريق استخدام الخلايا الجذعية في أنظمة شارك في ثقافة ^51-56. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم تدرج أيضا في مجالات متنوعة مثل أمراض الكلى ^57،58، والتفاعلات البطانية والأوعية الدموية ^59-62، موت الخلايا المبرمج يشير ^63-65، والتهاب في السمنة ومتلازمة الأيض ^{22،23،66-67،} الأذن الداخلية حماية خلايا الشعر ^68،69، وحتى في فطر الفوعة ^70،71 و ^72،73 الطفيليات.

تقدم هذه المقالة المبادئ التوجيهية المنهجية العامة من أجل اقامة experimوالأنف والحنجرة في ضوء تقييم التغيرات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان يفرز باستخدام نظام إدراج ثقافة مشتركة. على وجه الخصوص، سوف نركز اهتمامنا على الخلايا العصبية المشترك الثقافات واستخداماتها في دراسة عملية neuroinflammatory. وبالنظر إلى طيف واسع جدا من التجارب التي تدرج تجعل من الممكن التجريبية، فإنه أمر لا يطاق لتغطية كل من هذه التقنية زراعة الخلايا الجانب. وكمثال على ذلك، بروتوكول معين لقياس آثار السيتوكينات التي يفرزها lipopolysaccharide في (LPS) -activated الخلايا الدبقية الصغيرة N9 على الخلايا PC12 العصبية سيتم تفصيله، وتقديم فهم ملموس منهجية إدراج ثقافة مشتركة.

Protocol

ملاحظة: كل من الخطوات التالية يجب أن تتم تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي على النحو المطلوب لزراعة الخلايا الثديية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المبادئ التوجيهية العامة للزراعة الخلايا العقيمة المثلى تنطبق، على سبيل المثال.، ونبذ نصائح أي وقت أنها قد تؤدي إلى التل?…

Representative Results

استخدام نظم شارك في ثقافة إدراج يرتدي أهمية خاصة في دراسة العمليات neuroinflammatory التي تظهر العلاقات نظير الصماوي بين اللاعبين الخلوية المختلفة للجهاز العصبي المركزي. ويتم إنجاز الحصانة في الجهاز العصبي المركزي بشكل رئيسي من قبل خلايا مقيمة تسمى الخلا?…

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في أي نظام تجربة إدراج ثقافة مشتركة يسكن فعلا في اختيار إدراج المناسب لاستخدامها. يجب أن تؤخذ حجم المسام والمواد غشاء بعين الاعتبار شامل، دون أن ننسى أن تنظر في نوع من الخلايا التي سيتم المصنف، والغرض من هذه التجربة. على سبيل المثال، قد المقايسات c…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum