Développement d'un système d'insertion Co-culture de deux types cellulaires en l'absence de Cell-Cell Contactez

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

L'étude des tissus, des organes ou des systèmes in vitro est un essai de simplifier les relations complexes qui existent entre les sous – types cellulaires différents qui comprennent des organismes multicellulaires. En effet, des études in vitro permettent d'acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules isolées. Il y a deux principaux avantages de la conduite des expériences in vitro: 1) réduit les interactions cellulaires, et 2) la capacité de manipuler facilement l'environnement cellulaire. Par conséquent, ces deux avantages ont permis aux scientifiques de prédire le comportement des types cellulaires spécifiques in vivo, conduisant à la capacité de réguler les résultats des influences extrinsèques dans des organismes entiers. En ce sens, la culture in vitro de cellules dans fonctionne souvent comme un pont reliant les sciences fondamentales et appliquées vie. Néanmoins, il y a aussi plusieurs inconvénients du travail in vitro, le plus important étant qu'une certaine réserve peut demeurer dans le physiologiqueal pertinence des phénotypes observés. En effet, quand un seul type de cellule est cultivée dans un récipient, la culture perd, à des degrés divers, ses connexions cellule-cellule avec d'autres types de cellules, sa contribution à l'environnement humorale du tissu et de l'organisme d'origine, et les ancres au sein le tissu qui lui a permis de faire respecter une structure tridimensionnelle particulière, parfois crucial pour la fonction cellulaire.

La question des relations cellule-cellule a été adressée par le développement des techniques de culture mixtes. Dans ce procédé, deux ou plusieurs populations de cellules sont cultivées dans le même récipient de culture. Cependant, ces cultures mixtes portent des inconvénients importants. D'une part, certains sous-types de cellules n'interagissent pas physiquement avec l'autre dans le tissu d'origine et reposent uniquement sur les communications paracrines soutenues par des facteurs solubles sécrétés et récepteurs à proximité. Tel est le cas pour plusieurs processus inflammatoires qui dépendent de la signalisation des cytokines proximale. Dans mixte cULTURES, les interactions physiques sont inévitables et il est impossible d'étudier les communications paracrines en l'absence de contacts cellule-cellule qui peut donner des résultats modifiés. D'autre part, la réalisation des interprétations spécifiques de cellules à partir d'une population mixte devient impossible sans l'utilisation de techniques de séparation difficiles qui pourraient affecter de manière significative les résultats.

Pour résoudre ces questions importantes, l'utilisation des médias conditionnés a été développé comme une technique permettant des cultures compartimentées et l'étude de la signalisation paracrine. Cette méthode nécessite le transfert du surnageant d'un type de cellule, le milieu conditionné ainsi nommé, aux puits contenant une autre population de cellules. Mais un inconvénient important est que les molécules de courte durée ne survivent pas assez longtemps dans le milieu conditionné à être transféré dans les puits de la seconde population de cellules. Même les molécules longue durée de vie sera grandement dilué au fil du temps en raison de la diffusion. En outre, les deux cellulespopulations ne participent à la communication paracrine unidirectionnel plutôt que dans une communication bidirectionnelle active. Cela conduit à l'absence de signaux de rétroaction qui est essentielle pour recréer les relations exactes pluricellulaires tels qu'ils existent in vivo.

En conséquence , et entraînée par la nécessité de mieux simuler l'original dans des conditions in vivo dans l'environnement cellulaire in vitro, de nombreux progrès dans les techniques de culture cellulaire ont été réalisées au cours des années. L' un des progrès les plus significatifs a été l'utilisation de supports perméables avec des membranes microporeuses pour compartimenter des cultures de cellules, utilisées pour la première fois par Grobstein en 1953 ^1. De tels supports perméables ont été adaptés au fil des ans pour accueillir de nombreux types de cellules et à utiliser dans plusieurs applications différentes. Aujourd'hui, ces supports existent comme des inserts creux qui sont conçus pour reposer dans les puits d'une plaque de culture tissulaire multipuits ou circuplats lar. Dans un système de co-culture, l'insert contient un type de cellule tandis que le puits ou l'autre plat contient population cellulaire, ce qui permet d'étudier la contribution de deux populations différentes de cellules de leur environnement humorale (figure 1). En conséquence, la polarité cellulaire (basolatérale ou apicale contre la sécrétion réception du signal) est conservé, ce qui confère ainsi des systèmes de co-culture insérer un avantage important par rapport aux cultures mixtes et des techniques milieu conditionné. Plusieurs types de matériaux de membrane sont disponibles, les plus courantes étant du polyester (PET), le polycarbonate (PC) ou du collagène revêtu de polytétrafluoroéthylène (PTFE), et ils existent en différentes tailles de pores allant de 0,4 um à 12,0 um. Ces variétés de matériaux et de tailles des pores offrent un spectre d'inserts exerçant des caractéristiques variables pertinentes aux propriétés optiques, l'épaisseur de la membrane et l'adhérence des cellules qui les rendent pratiques à différents niveaux pour les utilisations suivantes sans s'y limiter:
-étudierla différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la métastase tumorale et la réparation des plaies par des dosages chimiotactiques à travers des membranes perméables;
-evaluating la pénétration du médicament en évaluant leur transport à travers des monocouches épithéliales ou endothéliales cultivées sur des supports perméables, et;
cellules co-cultures -Exécution pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule.

Le but de cet article est de décrire les lignes directrices méthodologiques générales pour remplir la troisième fonction indiquée ci-dessus, qui est d'évaluer les changements cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule en utilisant un système de co-culture insert. Plusieurs domaines de recherche différents utilisent des systèmes insert de co-culture, afin de répondre à des questions pertinentes à l'effet de facteurs solubles sécrétés sur les populations de cellules. En effet, la signalisation paracrine qui module le comportement cellulaire à différents niveaux est pertinent dans tous les tissuset les systèmes, ce qui rend les systèmes de co-culture insertion indispensable pour assurer des progrès dans ces domaines. A l'inverse, l'utilisation d'inserts peut confirmer que la transduction du signal se fait par le contact direct de cellule à cellule, et non par des facteurs sécrétés. L' une des utilisations les plus importantes des inserts est dans les études de l' inflammation ^2-14 où l'effet de cytokines sécrétées est évaluée à différents acteurs cellulaires de l' immunité. En particulier, l'étude de l' inflammation dans le système nerveux central (SNC) a grandement profité des études insert de co-culture, qui ont permis de mieux définir les rôles paracrines distincts de neurones et les microglies dans neuroinflammation ^15-21 conduite. Ces systèmes ont été conçus aussi pour étudier le potentiel anti-inflammatoire des molécules repose sur leur capacité à réduire ou à inhiber la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires ^22-26. La recherche portant sur ​​le cancer ^27-31, en ​​particulier les mécanismes sous – jacents de l' angiogenèse ^32-34 et inflammatisur ^35-42 dans la tumorigenèse, bénéficie également de systèmes insert de co-culture. En outre, des facteurs solubles sont de première importance dans les processus qui conduisent la différenciation et plusieurs études ont utilisé des inserts pour répondre aux questions dans ce domaine particulier ^43-50. Dans le SNC, car le tissu neural possède un potentiel de renouvellement très limité, l'étude de la neuroprotection et neurotrophism est fondamental et a été largement assurée par l'utilisation de cellules souches dans des systèmes de co-culture ^51-56. En outre, les inserts sont également utilisés dans les domaines aussi variés que la néphrologie ^57,58, les interactions endothéliales et l' angiogénèse ^{59-62, 63-65} signalisation de l' apoptose, l' inflammation dans l' obésité et le syndrome métabolique ^22,23,66-67, l' oreille interne de protection des cellules ciliées ^68,69, et même dans la virulence des champignons ^70,71 et parasitologie ^72,73.

Cet article propose des lignes directrices méthodologiques générales afin de mettre en place un expériment en vue d'évaluer les modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en utilisant un système de co-culture insert. En particulier, nous allons nous concentrer notre attention sur cellules nerveuses co-cultures et leurs utilisations dans l'étude de processus de neuroinflammatoire. Compte tenu de la très vaste éventail d'expériences qui insère permettre au pilote, il est insupportable pour couvrir tous les aspects de cette technique de culture cellulaire. A titre d'exemple, un protocole spécifique pour mesurer les effets des cytokines sécrétées par le lipopolysaccharide (LPS) -activated microglie N9 sur les cellules PC12 neuronales seront détaillées, offrant une compréhension concrète de la méthodologie insert co-culture.

Protocol

NB: Chacune des étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire tel que requis pour la culture cellulaire de mammifère. En outre, les lignes directrices générales pour la culture optimale des cellules stériles appliquent, par exemple., En écartant des conseils chaque fois qu'ils peuvent conduire à la contamination croisée, ce qui réduit la quantité de cellules de temps sont exposés à l'air lors de l' exécution des changements de …

Representative Results

L'utilisation de systèmes de co-culture insert est particulièrement pertinente dans l'étude des processus neuro-inflammatoires qui mettent en valeur les relations paracrines entre les différents acteurs cellulaires du système nerveux central. Immunité dans le SNC est réalisée principalement par les cellules résidentes appelées microglies qui surveillent leur environnement dans leur état ​​de repos ramifiées (Figure 2A) et sont capables de perturba…

Discussion

L'étape la plus critique de toute expérience du système insert co-culture réside effectivement dans le choix de l'insert approprié à utiliser. La taille des pores et le matériau de la membrane doivent être prises en compte en profondeur, sans oublier de considérer le type de cellules qui seront ensemencées et le but de l'expérience. Par exemple, des dosages chimiotactiques peuvent utiliser le même type de membrane que les co-cultures cellulaires pour analyser les modulations du comportement cellu…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum