Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

Die Untersuchung von Geweben, Organen oder Systemen in vitro ist ein Versuch , die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zellsubtypen bestehenden zu vereinfachen , die mehrzellige Organismen umfassen. Tatsächlich de – vitro – Studien ermöglichen es , ein detailliertes Verständnis der einzelnen Zellpopulationen zu erwerben. Es gibt zwei Hauptvorteile von in vitro Experimenten Durchführung: 1) zellulare Wechselwirkungen reduziert, und 2) die Fähigkeit, leicht die zelluläre Umgebung manipulieren. Daher haben diese beiden Vorteile erlaubt, das Verhalten von spezifischen Zelltypen in vivo vorherzusagen, zu der Fähigkeit führen Ergebnisse der extrinsischen Einflüsse in ganzen Organismen zu regulieren. In diesem Sinne arbeitet de – vitro – Zellkultur oft als Brücke zwischen Grund- und Lebenswissenschaften angewendet. Dennoch gibt auch mehrere Nachteile der Arbeit in vitro sind, die wichtigste ist , daß eine gewisse Vorbehalte in der physiologischen wohnenal Relevanz der beobachteten Phänotypen. Tatsächlich, wenn ein Zelltyp ist, in einem Gefäß aufgewachsen, die Kultur verliert, in unterschiedlichem Umfang, dessen Zell-Zell-Verbindungen mit anderen Zelltypen, ihren Beitrag zur humoralen Umgebung aus dem Gewebe und Herkunftsorganismus und den Anker innerhalb das Gewebe, das es ermöglicht, eine bestimmte dreidimensionale Struktur manchmal entscheidend für die Zellfunktion aufrecht zu erhalten.

Die Frage nach der Zell-Zell-Beziehungen wurde durch die Entwicklung der Mischkultur-Techniken gerichtet. In diesem Verfahren werden zwei oder mehr Zellpopulationen miteinander in dem gleichen Kulturgefäß gezüchtet. Allerdings tragen diese Mischkulturen wichtige Nachteile. Einerseits nicht physisch miteinander in dem Ursprungsgewebe und verlassen sich ausschließlich auf parakrine Kommunikations getragen von sezernierten löslichen Faktoren und in der Nähe Rezeptoren interagieren einige Zellsubtypen. Dies ist der Fall für mehrere entzündliche Prozesse, die auf proximalen Cytokine Signaling abhängen. In gemischten cultures, physikalische Wechselwirkungen sind unvermeidbar und es unmöglich machen, parakrine Kommunikation in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakte zu studieren, die veränderten Ergebnisse liefern kann. Auf der anderen Seite wird, ohne die Verwendung von ätzenden Trenntechniken undurchführbar zellspezifische Interpretationen aus einer gemischten Population zu erzielen, die deutlich Ergebnisse beeinflussen könnten.

Um diese wichtige Probleme zu lösen, wurde die Verwendung von konditionierten Medien wurden als eine Technik entwickelt, so dass für compartmentalized Kulturen und das Studium der parakrinen Signalisierung. Dieses Verfahren erfordert den Transfer des Überstands eines Zelltyps, so konditionierte Medium benannte in die Vertiefungen einer anderen Population von Zellen enthält. Noch ein wichtiger Nachteil ist, dass kurzlebige Moleküle überleben nicht lange genug in dem konditionierten Medium zu den Vertiefungen der zweiten Population von Zellen zu übertragen. Auch langlebige Moleküle stark im Laufe der Zeit wird durch Diffusion verdünnt. Außerdem sind sowohl ZellPopulationen teilnehmen nur in einer Richtung parakrine Kommunikation statt in aktive bidirektionale Kommunikation. Dies führt zur Abwesenheit von Rückkopplungssignalisierung , die in Neuer genaue vielzelligen Beziehungen wichtig ist , da sie in vivo existieren.

Als Folge und durch die Notwendigkeit , in der in vitro Zellumgebung haben , um besser simulieren die ursprünglichen de – vivo – Bedingungen angetrieben wird , mehrere Fortschritte in der Zellkulturtechniken wurden im Lauf der Jahre erreicht. Einer der bedeutendsten Fortschritte hat Kompartimentierung Zellkulturen, die Verwendung von durchlässigen Träger mit mikroporösen Membranen wurden zum ersten Mal von Grobstein 1953 ¹ verwendet. Solche permeable Träger über die Jahre zugeschnitten wurden zahlreiche Zelltypen zu unterstützen und zu verwende in verschiedenen Anwendungen. Heute existieren diese Träger als Hohl Einsätzen, die in den Vertiefungen von einer Multi-Well-Gewebekulturplatte ruhen sollen oder in circular Speisen. In einem Co-Kultursystem, enthält der Einsatz einen Zelltyp , während die Vertiefung oder Schale enthält die anderen Zellpopulation, um den Beitrag von zwei verschiedenen Populationen von Zellen auf ihrer humoralen Umgebung zu studieren ermöglicht (Figur 1). Als Ergebnis erhalten bleibt Zellpolarität (basolaterale vs apikal Sekretion oder Signalempfang), so dass Einsatz Co-Kultur-Systeme einen wichtigen Vorteil gegenüber Mischkulturen und konditioniertes Medium Techniken verleihen. Verschiedene Arten von Membranmaterialien zur Verfügung, die gebräuchlichsten sind Polyester (PET), Polycarbonat (PC) oder Polytetrafluorethylen (PTFE) mit Kollagen beschichteten und sie existieren in verschiedenen Porengrößen von 0,4 & mgr; m bis 12,0 & mgr; m reichen. Diese Sorten von Materialien und Porengrößen bieten ein Spektrum von Einsätzen variable relevanten Merkmale optischen Eigenschaften, Membrandicke und Zellhaft ausübt, die sie praktisch auf unterschiedlichen Ebenen für den folgenden machen Verwendungen nicht beschränkt auf:
-studyingZelldifferenzierung, die embryonale Entwicklung, Tumormetastasen und Wundreparatur durch chemotaktische Assays durchlässige Membranen;
-Bewertung Wirkstoffpenetration durch den Transport durch epitheliale oder endotheliale Monolayern Beurteilung kultiviert auf durchlässigen Träger, und;
-Beim Ausführen Zelle Kokulturen Modulationen Zellverhalten, induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu analysieren.

Der Zweck dieses Artikels ist allgemeinen methodischen Richtlinien beschreiben die dritte Funktion oben angegeben zu erfüllen, die die zelluläre Veränderungen von sezernierten löslichen Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelt zu bewerten ist. Mehrere verschiedene Forschungsbereiche nutzen Einsatz Co-Kultursystemen, um Fragen, die die Wirkung von sekretierten löslichen Faktoren auf Populationen von Zellen zu beantworten. Tatsächlich parakrine Signalisierung, die auf verschiedenen Ebenen Zellverhalten moduliert ist relevant in allen Gewebenund Systeme, die Insert-Co-Kultursystemen macht unentbehrliche Fortschritte in diesen Bereichen zu gewährleisten. Umgekehrt kann die Verwendung von Einsätzen, welche die Signaltransduktion bestätigen ist durch direkte Zell-Zell-Kontakt und nicht durch sekretierte Faktoren. Eine der wichtigsten Anwendungen von Einsätzen ist in Entzündungsstudien ^2-14 , wo der Effekt von sekretierten Zytokinen in verschiedenen zellulären Immunität Spieler ausgewertet wird. Insbesondere hat die Untersuchung der Entzündung im zentralen Nervensystem (ZNS) profitiert sehr von Insert Kokultur Studien, die besser erlaubt haben , die zu dem unterscheidbaren parakrine Funktionen von Neuronen und Mikroglia Definition in ^15-21 neuroinflammation fahren. Diese Systeme wurden auch die entzündungshemmende Potential von Molekülen zu untersuchen entwickelt , die auf ihrer Fähigkeit beruht zu verringern oder die Sekretion von entzündungsfördernden Faktoren ^22-26 hemmen. Betreffend Forschung insbesondere zur Krebs ^27-31, die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese ^32-34 und inflammatiauf ^35-42 in tumorigenesis, profitiert auch von Insert – Co-Kultursystemen. Darüber hinaus sind lösliche Faktoren von zentraler Bedeutung in den Prozessen , die verwendet wurden Einsätze Differenzierung und mehrere Studien treiben ^43-50 Fragen in diesem speziellen Bereich zu beantworten. Im ZNS, wie Nervengewebe zu sehen , hat eine sehr begrenzte Erneuerungspotential, das Studium der neurotrophism und Neuroprotektion ist von grundlegender Bedeutung und ^51-56 durch die Verwendung von Stammzellen in Kokultur Systemen weit sichergestellt ist. Darüber hinaus Einsätze sind auch in so unterschiedlichen Bereichen wie der Nephrologie ^57,58, endotheliale Wechselwirkungen und Angiogenese ^59-62, Apoptose Signalgebung ^63-65, Entzündung bei Adipositas und metabolisches Syndrom ^22,23,66-67, Innenohrhaarzellschutz genutzt ^68,69 und sogar in Pilz Virulenz ^70,71 und Parasitologie ^72,73.

Dieser Artikel bietet allgemeine methodische Leitlinien, um eine Experim einzurichtenent angesichts von sezerniert löslichen Faktoren unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem vermittelte zelluläre Veränderungen zu bewerten. Insbesondere werden wir unsere Aufmerksamkeit auf die Nervenzelle Co-Kulturen und deren Anwendung bei der Untersuchung neuroinflammatorische Prozess konzentrieren. das sehr breite Spektrum von Experimenten gegeben, die Piloten ermöglichen, einfügt, ist es unerträglich, jeden Aspekt dieser Zellkulturtechnik zu decken. Als Beispiel für ein bestimmtes Protokoll die Wirkungen von Zytokinen sezerniert messen Lipopolysaccharid (LPS) -aktivierten wird N9 Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen detailliert, ein konkretes Verständnis der Einsatz Kokultur Methodologie bietet.

Protocol

NB: Jeder der folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, wie für Säugetierzellkultur erforderlich. Darüber hinaus gelten die allgemeinen Richtlinien für die optimale sterile Zellkultur, z. B., Tipps jederzeit verwerfen sie zu Kreuzkontaminationen führen kann, die Verringerung der Menge an Zeit , Zellen der Luft ausgesetzt werden , wenn ganze Medienwechsel durchführen, richtig , aber vorsichtig alle Rühren Zellsuspensionen ihre homogene Pipettie…

Representative Results

Die Verwendung von Einsatz Co-Kultursystemen ist besonders relevant bei der Untersuchung von neuroinflammatorischen Prozesse, die parakrine Beziehungen zwischen verschiedenen zellulären Spieler des ZNS zeigen. Immunität im ZNS erfolgt in erster Linie von den ansässigen Zellen genannt Mikroglia, die ihre Umwelt in ihrem Ruhezustand verästelten (2A) zu überwachen und sind von Sensorstörungen fähig das könnte Probleme der sehr wertvollen Homöostase notwendig für d…

Discussion

Der kritischste Schritt jedes Einsatzes Kokultursystem Experiment verweilt tatsächlich in der richtigen Einsatz Wahl zu verwenden. Die Porengröße und Membranmaterial muss in gründliche Rechnung getragen werden, ohne zu vergessen, die Art der Zellen zu betrachten, und der Zweck des Experiments ausgesät werden. Beispielsweise Kontaktchemotaktische Assays können die gleiche Art von Membran als Zell Kokulturen verwenden, um Zellverhalten Modulationen analysieren induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwese…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum