פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

המחקר של רקמות, איברים או מערכות במבחנה הוא ניסיון לפשט את היחסים המורכבים מאוד הקיים בין תת הסלולר מספר המרכיבות יצורים רב-תאיים. ואכן, מחקרים במבחנה מאפשרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תא בודדות. ישנם שני יתרונות גדולים של עורכת ניסויים במבחנה: 1) מופחתים אינטראקציות הסלולר, ו -2) את היכולת לתפעל את הסביבה התאית בקלות. לפיכך, שני יתרונות אלה מדענים מותר לחזות את ההתנהגות של סוגי תאים מסוימים in vivo, שמוביל את היכולת לווסת תוצאות של השפעות חיצוניות באורגניזמים כולו. במובן זה, תרבית תאים במבחנה בדרך כלל עובדת כגשר מחבר מדעי חיים בסיסיים ויישומים. עם זאת, ישנם גם כמה חסרונות של עבודה במבחנה, אחד החשוב ביותר להיות כי הזמנה מסוימת עשויה לשכון הפיזיולוגיאל הרלוונטיות של פנוטיפים שנצפו. ואכן, כאשר סוג תא בודד הוא גדל בתוך סיר, התרבות מאבדת במידה שונה, קשרים בין התאים עם סוגי תאים אחרים, תרומתה לסביבת הלחות מן רקמות האורגניזם מוצא, ואת העוגנים בתוך הרקמה, שאיפשרה לו לקיים מבנה תלת ממדי בפרט לפעמים חיוני לתפקוד התא.

שאל יחסים בין תאים טופל על ידי הפיתוח של טכניקות תרבות מעורבות. בשיטה זו, שתיים או יותר אוכלוסיות תאים גדלות יחד באותו כלי התרבות. עם זאת, תרבויות המעורבות אלה לשאת טרדות חשובות. מצד אחד, תת תא מסוים אינו אינטראקציה פיזית עם אחד אחר בתוך הרקמה ממוצא ולהסתמך אך ורק על תקשורת paracrine שנגרמה גורמים מסיסים מופרשים קולטנים סמוכים. זהו המקרה במשך כמה תהליכים דלקתיים שתלויים איתות ציטוקינים הפרוקסימלי. ב- C מעורבתultures, אינטראקציות פיסיות הם בלתי נמנעות ולעשות את זה אי אפשר ללמוד תקשורת paracrine בהעדר קשר תאי תאים שיכולים להניב תוצאות שינו. מצד שני, השגת פרשנויות תא ספציפי מתוך אוכלוסייה מעורבת הופך ישים ללא שימוש בטכניקות הפרדה קשים שיש בהם כדי להשפיע באופן משמעותי תוצאות.

כדי לפתור סוגיות חשובות אלה, השימוש בתקשורת מותנית פותח כטכניקה המאפשרת תרבויות ממודרות וחקר האיתות אוטוקריני. שיטה זו דורשת העברת supernatant של סוג תא אחד, ובכך בשם בינוני מותנה, כדי בארות המכילות אוכלוסייה אחרת של תאים. עם זאת, חיסרון שחשוב זה מולקולות קצרת אינם שורדים מספיק זמן במדיום מותנה שיועברו הבארות של האוכלוסייה השנייה של תאים. גם מולקולות האריכה ימים ידוללו באופן משמעותי לאורך זמן עקב דיפוזיה. יתר על כן, הן תאאוכלוסיות להשתתף רק בתקשורת paracrine חד כיווני ולא בתקשורת דו-כיוונית פעילה. זה מוביל בהעדר איתות כי משוב הוא חיוני מחדש יחסים רב-תאיים מדויק ככל שהם קיימים in vivo.

כתוצאה מכך מונע על ידי הצורך לדמות את המקורי טוב יותר בתנאי vivo בסביבת הסלולר במבחנה, כמה התקדמות טכניקות תרבית תאים הושגה במהלך השנים. אחד הפיתוחים המשמעותיים ביותר כבר בשימוש תומך חדיר עם ממברנות microporous עבור מידור בתרביות תאים, השתמשו בפעם הראשונה על ידי Grobstein בשנת 1953 ^1. תומך חדיר כאלה כבר מותאם לאורך השנים כדי להתאים סוגי תאים רבים כדי לשמש בכמה יישומים שונים. כיום, עזרה כזאת להתקיים כתוספות חלולות אשר נועדו לנוח בבארות מתוך צלחת תרבות multiwell רקמות או circuמנות Lar. במערכת שיתוף תרבות, את הכנס מכיל סוג תא אחד ואילו הבאר או צלחת מכילה האוכלוסייה התאית האחרת, מה שמאפשר ללמוד את התרומה של שתי אוכלוסיות שונות של תאים על סביבת הלחות שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, קוטביות הסלולר (basolateral vs הפרשת פסגה או קבלת אות) נשמרה, ובכך מקנה מערכות שיתוף תרבות כנס יתרון חשוב על פני תרבויות מעורבות וטכניקות בינוניות מותנות. ישנם מספר סוגים של חומרי קרום זמינים, אלה הנפוצים ביותר פוליאסטר להיות (PET), פוליקרבונט (PC) או מצופה קולגן polytetrafluoroethylene (PTFE), והם קיימים בגדלים נקבוביים שונים הנעים בין 0.4 מיקרומטר 12.0 מיקרומטר. אלו סוגים של חומרים וגדלים נקבוביים מציעים קשת של הוסיף הפעלת תכונות משתנות רלוונטיות תכונות אופטיות, עובי קרום ודבק תא שהופכים אותם מעשיות ברמות שונות עבור השימושים הבאים לא מוגבלים ל:
-studyingהתמיינות תאים, התפתחות עוברית, גרורות של גידולים ותיקון פצע על ידי מבחני chemotaxic דרך ממברנות חדירות;
-evaluating חדירה התרופה על ידי הערכת התחבורה שלהם באמצעות monolayers אפיתל או אנדותל בתרבית על תומך חדיר, ו;
תא שיתוף תרבויות -ביצוע לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים.

מטרת מאמר זה היא לתאר שיקולים מתודיים הרחב למלא את הפונקציה השלישית כאמור לעיל, כי היא להעריך שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. שדות שונים של מחקר לעשות שימוש במערכות שיתוף תרבות הכנס על מנת לענות על שאלות רלוונטיות שפעת גורמים מסיסים המופרשים על אוכלוסיות של תאים. ואכן, איתות אוטוקריני כי מודולציה התנהגות הסלולר ברמות שונות היא רלוונטית בכל הרקמותומערכות, מה שהופך מערכות שיתוף תרבות הכנס הכרחית כדי להבטיח התקדמות בתחומים אלה. לעומת זאת, השימוש מוסיף יכול לאשר כי תמרת אות על ידי מגע תאי תאים ישיר ולא על ידי גורמים מופרשים. אחד השימושים החשובים ביותר של מוסיף הוא במחקרי דלקת ^2-14 בם ההשפעה של ציטוקינים מופרשים מוערכת ב שחקנים הסלולר שונים של חסינות. בפרט, המחקר של דלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS) הרוויח מאוד ממחקרי שיתוף תרבות כנס, אשר אפשרו עדיפה בהגדרת תפקידי paracrine הברור של נוירונים המיקרוגליאה נהיגת neuroinflammation ^15-21. מערכות אלו תוכננו גם ללמוד את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של מולקולות המסתמכת על יכולתם להפחית או למנוע את הפרשת גורמים פרו-דלקתיים ^22-26. מחקר הנוגע סרטן ^27-31, בפרט מנגנוני אנגיוגנזה ^32-34 ו inflammatiעל ^35-42 ב tumorigenesis, נהנה גם מערכות שיתוף תרבות הכנס. יתר על כן, גורמים מסיסים הם בעלות חשיבות עליונה בתהליכים שמניעי הבידול מספר מחקרים השתמשו מוסיף לענות על שאלות בדרך מסוימת שדה ^43-50. במערכת העצבים המרכזית, כמו לראות רקמה עצבית יש פוטנציאל התחדשות מוגבלת מאוד, חקר neurotrophism ו neuroprotection הוא יסודי כבר הבטיחו נרחב על ידי שימוש בתאי גזע במערכות שיתוף התרבות ^51-56. בנוסף, מוסיף גם מנוצלים בתחומים מגוונים כמו נפרולוגיה ^57,58, אינטראקציות האנדותל אנגיוגנזה ^59-62, אפופטוזיס איתות ^63-65, דלקת השמנה ותסמונת מטבולית ^22,23,66-67, אוזן פנימית הגנה על תאי שיער ^68,69, ואפילו ארסי פטריית ^70,71 ופרזיטולוגיה ^72,73.

מאמר זה מציע קווים מנחי מתודולוגיים כללי כדי להקים experimאף אוזן גרון לאור הערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. בפרט, נוכל למקד את תשומת הלב שלנו על תרבויות-שיתוף תא העצב ואת השימושים שלהם בלימוד תהליך neuroinflammatory. בהתחשב הספקטרום רחב מאוד של ניסויים מוסיף לאפשר לטייס, זה בלתי נסבל לכסות כל היבט של טכניקת תרבית תאים זה. כדוגמא, פרוטוקול ספציפי כדי למדוד את ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia N9 על תאי PC12 עצביים שיפורט, מציע הבנה בטון של המתודולוגיה שיתוף תרבות כנס.

Protocol

נ.ב: כל אחד מן השלבים הבאים צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית כנדרש על תרבית תאים יונקת. בנוסף, ההנחיות הכלליות לגידול תאים סטריליים אופטימליים להחיל, למשל., השלכת טיפים בכל עת שהם עלולים לגרום זיהום צולב, הפחתת כמות תאי הזמן נחשפים לאוויר בעת ביצוע …

Representative Results

השימוש במערכות שיתוף תרבות כנס רלוונטי במיוחד בחקר של תהליכי neuroinflammatory שופכי אור יחסי paracrine בין שחקנים סלולריים השונים של מערכת העצבים המרכזית. חסינות של מערכת העצבים המרכזי מושגת בעיקר על ידי תאי תושב קרואי מיקרוגליאה מנטר סביבתם במצב מסועף הנח של…

Discussion

השלב הקריטי ביותר של כל ניסוי מערכת שיתוף תרבות כנס למעשה שוכן בבחירת הכנס הראוי לשימוש. גודל נקבובי וחומר קרום חייבים להילקח בחשבון יסודי, מבלי לשכוח לקחת בחשבון את הסוג של תא יהיה זורע ואת מטרת הניסוי. לדוגמה, מבחני chemotaxic עשויים להשתמש באותו סוג של קרום מ שיתוף תרבו?…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum