Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

El estudio de los tejidos, órganos o sistemas in vitro es un intento de simplificar las muy complejas relaciones existentes entre los varios subtipos celulares que comprenden organismos multicelulares. De hecho, los estudios in vitro hacen posible adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Hay dos ventajas principales de la realización de los experimentos in vitro: 1) la reducción de las interacciones celulares, y 2) la capacidad de manipular fácilmente el entorno celular. Científicos Por lo tanto, estas dos ventajas han permitido a predecir el comportamiento de determinados tipos de células in vivo, dando lugar a la capacidad de regular los resultados de las influencias extrínsecas en organismos completos. En ese sentido, el cultivo in vitro de células de frecuencia funciona como un puente que conecta las ciencias básicas y aplicadas de vida. No obstante, hay también varias desventajas de trabajar in vitro, el más importante siendo que una determinada reserva habite en el fisiológicaal pertinencia de fenotipos observados. De hecho, cuando un solo tipo de células se cultiva en un recipiente, la cultura pierde, en diversa medida, sus conexiones célula-célula con otros tipos de células, su contribución al medio ambiente humoral del tejido y el organismo de origen, y las anclas dentro el tejido que le permitió mantener una estructura tridimensional determinada veces crucial para la función celular.

La cuestión de relaciones célula-célula ha sido abordado por el desarrollo de técnicas de cultivo mixto. En este método, dos o más poblaciones de células se cultivan conjuntamente en el mismo recipiente de cultivo. Sin embargo, estos cultivos mixtos tienen inconvenientes importantes. Por un lado, algunos subtipos de células no interactúan físicamente con otros en el tejido de origen y se basan únicamente en las comunicaciones paracrinos sufridas por factores solubles secretadas y los receptores cercanos. Este es el caso para varios procesos inflamatorios que dependen de la señalización de citoquinas proximal. En c mixtaultures, interacciones físicas son inevitables y hacen imposible el estudio de las comunicaciones paracrinos en la ausencia de contactos célula-célula que puede producir resultados alterados. Por otra parte, la consecución de las interpretaciones de células específicas dentro de una población mixta se vuelve inviable sin el uso de técnicas de separación duras que podrían afectar significativamente los resultados.

Para resolver estos problemas importantes, el uso de medios acondicionados se ha desarrollado como una técnica que permite a las culturas compartimentados y el estudio de señalización paracrina. Este método requiere la transferencia del sobrenadante de un tipo de célula, media llamada así acondicionado, a los pocillos que contienen otra población de células. Sin embargo, una desventaja importante es que las moléculas de vida corta no sobreviven el tiempo suficiente en el medio condicionado para ser transferidos a los pocillos de la segunda población de células. Incluso moléculas de larga vida se diluirán en gran medida con el tiempo debido a la difusión. Además, tanto celularpoblaciones sólo participan en la comunicación paracrina unidireccional en lugar de en la comunicación bidireccional activo. Esto conduce a la ausencia de señalización de realimentación que es de vital importancia en la recreación de las relaciones multicelulares precisos tal como existen en vivo.

Como consecuencia de ello y conducido por la necesidad de simular mejor el original pt condiciones in vivo en el entorno celular in vitro, varios avances en técnicas de cultivo celular se han alcanzado en los últimos años. Uno de los avances más importantes ha sido el uso de soportes permeables con membranas microporosas para compartimentar cultivos de células, que se utilizan por primera vez por Grobstein en 1953 ^1. Tales soportes permeables se han adaptado durante los años para dar cabida a numerosos tipos de células y para ser utilizado en varias aplicaciones diferentes. Hoy en día, estos soportes existen insertos como huecos que están diseñados para descansar en los pozos de una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos o en circuplatos lar. En un sistema de co-cultivo, el inserto contiene un tipo de célula, mientras que el pozo o plato contiene la otra población celular, lo que permite el estudio de la contribución de las dos poblaciones diferentes de células en su entorno humoral (Figura 1). Como resultado, la polaridad celular (basolateral vs secreción apical o recepción de la señal) se conserva, lo que confiere sistemas de inserción de co-cultivo una ventaja importante sobre cultivos mixtos y técnicas de medio acondicionado. Existen varios tipos de materiales de membrana están disponibles, los más comunes son de poliéster (PET), policarbonato (PC) o colágeno recubierto de politetrafluoroetileno (PTFE), y existen en diferentes tamaños de poro que van de 0,4 micras a 12,0 micras. Estas variedades de materiales y tamaños de poro ofrecen un espectro de insertos que ejercen funciones variables relevantes a las propiedades ópticas, espesor de la membrana celular y la adhesión que los hacen práctica a diferentes niveles para los siguientes usos no se limitan a:
-estudiandola diferenciación celular, el desarrollo embrionario, la metástasis tumoral y la reparación de heridas mediante ensayos quimiotácticas a través de membranas permeables;
-Evaluar la penetración del fármaco mediante la evaluación de su transporte a través de monocapas epiteliales o endoteliales cultivadas en soportes permeables, y;
-Realizar de células co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula.

El propósito de este artículo es describir las pautas metodológicas generales para cumplir con la tercera función se ha indicado anteriormente, que consiste en evaluar los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. Varios campos diferentes de investigación hacen uso de los sistemas de inserción de co-cultivo con el fin de responder a las preguntas relacionadas con el efecto de factores solubles secretadas en las poblaciones de células. De hecho, la señalización paracrina que modula el comportamiento celular en varios niveles es pertinente en todos los tejidosy sistemas, lo que hace que los sistemas de co-cultivo de inserción indispensable para garantizar los avances en estos campos. Por el contrario, el uso de insertos puede confirmar que la transducción de señales es por contacto directo célula-célula y no por factores secretados. Uno de los usos más importantes de inserciones en los estudios es la inflamación ^2-14, donde se evalúa el efecto de las citoquinas secretadas en varios jugadores celulares de la inmunidad. En particular, el estudio de la inflamación en el sistema nervioso central (SNC) se ha beneficiado enormemente de los estudios de inserción de co-cultivo, que han permitido a definir mejor las funciones paracrinas distintos de neuronas y la microglia en la conducción de la neuroinflamación ^15-21. Estos sistemas también se diseñaron para estudiar el potencial anti-inflamatorio de moléculas que se basa en su capacidad para reducir o inhibir la secreción de factores pro-inflamatorias ^22-26. Investigaciones relacionadas con el cáncer de ^{27 a 31,} en ​​particular, los mecanismos de la angiogénesis ^32-34 y inflammati subyacenteen ^35-42 en la tumorigénesis, también se beneficia de los sistemas de inserción de co-cultivo. Por otra parte, los factores solubles son de gran importancia en los procesos que conducen a la diferenciación y varios estudios han utilizado inserciones para responder preguntas en ese campo en particular ^43-50. En el SNC, ya que el tejido neural tiene un potencial de renovación muy limitado, el estudio de neurotrophism y neuroprotección es fundamental y ha sido ampliamente asegurada por el uso de células madre en los sistemas de co-cultivo de ^51-56. Además, las inserciones también se utilizan en campos tan diversos como la nefrología ^57,58, interacciones endoteliales y la angiogénesis ^{59-62, 63-65} apoptosis de señalización, la inflamación en la obesidad y el síndrome metabólico ^22,23,66-67, oído interno de protección de las células ciliadas ^68,69, e incluso en la virulencia de hongos ^70,71 y ^72,73 parasitología.

En este artículo se ofrece pautas metodológicas generales con el fin de establecer un experiment a la vista de la evaluación de los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. En particular, nos centraremos nuestra atención en las células nerviosas co-cultivos y sus usos en el estudio de procesos neuroinflammatory. Dado el amplio espectro de los experimentos que se inserta hacer posible proyectos piloto, es insoportable para cubrir todos los aspectos de esta técnica de cultivo celular. A modo de ejemplo, un protocolo específico para medir los efectos de las citoquinas secretadas por lipopolisacárido (LPS), activado microglia N9 en las células PC12 neuronales se detallará, que ofrece una comprensión concreta de la metodología de inserción de co-cultivo.

Protocol

Nota: Cada uno de los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar como se requiere para el cultivo de células de mamíferos. Además, las directrices generales para el cultivo celular estéril óptima se aplican, por ejemplo., Descartando consejos en cualquier momento que pueden dar lugar a la contaminación cruzada, lo que reduce la cantidad de células momento en que se expone al aire cuando se realizan cambios en los medios enteros, adecuadamente, pero con cui…

Representative Results

El uso de sistemas de co-cultivo de inserción es particularmente pertinente en el estudio de los procesos neuroinflammatory que muestran las relaciones entre los diferentes actores paracrinos celulares del sistema nervioso central. Inmunidad en el SNC se logra principalmente por células residentes microgliales, que supervisan su entorno en su estado de reposo ramificada (Figura 2A) y son capaces de alteraciones de percepción que pudiera molestar al homeostasis muy val…

Discussion

El paso más crítico de cualquier sistema de inserción experimento de co-cultivo realidad habita en la elección de la inserción correcta de usar. El tamaño de poro y material de la membrana se deben tener en cuenta a fondo, sin olvidar a considerar el tipo de células que se sembraron y el propósito del experimento. Por ejemplo, los ensayos de quimiotácticas pueden utilizar el mismo tipo de membrana de células que co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum