Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

Studiet av vävnader, organ eller system in vitro är ett försök att förenkla mycket komplexa relationer som finns mellan de olika celltyper som utgör flercelliga organismer. Faktum är att i vitro studier gör det möjligt att förvärva en detaljerad förståelse av enkelcellpopulationer. Det finns två stora fördelar med att utföra in vitro-experiment: 1) reducerade cellulära interaktioner, och 2) förmågan att lätt manipulera den cellulära miljön. Därför har dessa två fördelar tillåtna forskare att förutsäga beteendet hos vissa celltyper in vivo, vilket leder till möjligheten att reglera resultatet av yttre influenser i hela organismer. I den meningen fungerar in vitro cellkultur ofta som en bro som förbinder grundforskning och tillämpad biovetenskap. Icke desto mindre finns det också flera nackdelar med att arbeta in vitro, den viktigaste är att en viss reservation får bo i den fysiologiskaal relevans observerade fenotyper. Det är när en enda celltyp odlas i ett kärl, kulturen förlorar, till olika grad, dess cell-cell kontakter med andra celltyper, dess bidrag till den humorala miljön från vävnaden och organism ursprung och ankare inom vävnaden som gjorde det möjligt att upprätthålla en viss tredimensionell struktur ibland avgörande för cellfunktion.

Frågan om cell-cell relationer har behandlats av utvecklingen av blandade odlingstekniker. I denna metod används två eller flera cellpopulationer som odlas tillsammans i samma odlingskärl. Dessa blandade kulturer bär viktiga olägenheter. Å ena sidan har vissa celltyper inte fysiskt interagerar med varandra i vävnaden av ursprung och enbart förlita sig på parakrina kommunikation drabbar utsöndrade lösliga faktorer och närliggande receptorer. Detta är fallet för flera inflammatoriska processer som är beroende av proximala cytokin signalering. I blandade cultures fysiska interaktioner är oundvikliga och gör det omöjligt att studera parakrina kommunikation i avsaknad av cell-cell kontakter som kan ge förändrade resultat. Å andra sidan, att uppnå cellspecifika tolkningar inifrån en blandad befolkning blir omöjligt utan användning av starka separationstekniker som väsentligt kan påverka resultaten.

För att lösa dessa viktiga frågor, har användningen av konditionerat medium utvecklats som en teknik som möjliggör compartmentalized kulturer och studiet av parakrina signalering. Denna metod kräver en överföring av supernatanten från en celltyp, således namnges konditionerat medium, till brunnarna innehållande en annan population av celler. Ännu, är en viktig nackdel att kortlivade molekyler inte överlever tillräckligt länge i det konditionerade mediet som skall överföras till brunnarna i den andra populationen av celler. Även långlivade molekyler kommer att bli mycket utspädd med tiden på grund av diffusion. Vidare både cellpopulationer endast delta i enkelriktad parakrin kommunikation snarare än i aktiv dubbelriktad kommunikation. Detta leder till frånvaro av återkopplingssignaleringen som är avgörande för att återskapa exakta flercelliga relationer som de existerar in vivo.

Som en följd av detta och drivs av behovet att bättre simulera originalet in vivo förhållanden i den cellulära miljön in vitro, har flera framsteg i cellodlingstekniker gjorts under årens lopp. En av de viktigaste framstegen har varit användningen av genomträngliga bärare med mikroporösa membran för compartmentalizing cellkulturer, som används för första gången av Grobstein 1953 ^1. Sådana genomträngliga stöd har skräddarsytts under åren för att rymma ett stort antal celltyper och användas i flera olika applikationer. Numera dessa bärare existerar som ihåliga insatser som är utformade för att vila i brunnar från en flerkällsvävnadsodlingsplatta eller i circunande rätter. I en samodlingssystemet, innehåller insatsen en celltyp, medan brunnen eller skålen innehåller den andra cellulära populationen, gör det möjligt att studera bidraget från två olika populationer av celler på deras humorala miljön (figur 1). Som ett resultat, är cellulär polaritet (basolaterala vs apikala sekre eller signalmottagning) konserveras, vilket ger insats co-odlingssystem en viktig fördel jämfört med blandade kulturer och konditionerat medium tekniker. Flera typer av membranmaterial är tillgängliga, men de vanligaste är polyester (PET), polykarbonat (PC) eller kollagen-överdragna polytetrafluoreten (PTFE), och de existerar i olika porstorlekar som sträcker sig från 0,4 ^ m till 12,0 | am. Dessa sorter av material och porstorlekar erbjuda ett spektrum av insatser utövar varierande egenskaper som är relevanta för optiska egenskaper, membrantjockleken och cellvidhäftning som gör dem praktiskt på olika nivåer för följande användningar inte begränsat till:
-studerarcelldifferentiering, embryonal utveckling, tumörmetastas och sårläkning genom chemotaxic analyser genom permeabla membran;
-evaluating läkemedelspenetration genom att bedöma deras transport genom epitelceller eller endotelceller monolager odlas på släppliga stöd, och;
-performing cell samkulturer att analysera cellbeteende modulationer inducerade av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cellkontakt.

Syftet med denna artikel är att beskriva de allmänna metodologiska riktlinjer för att uppfylla den tredje funktionen som anges ovan, som är att utvärdera cellförändringar som medieras av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cell kontakt med en insats samodlingssystemet. Flera olika forskningsområden utnyttja insats co-odlingssystem för att svara på frågor som är relevanta för effekten av utsöndrade lösliga faktorer populationer av celler. Faktum är parakrin signalering som modulerar cellulär beteende på olika nivåer är relevant i alla vävnaderoch system, vilket gör insats co-odlingssystem oumbärlig för att säkerställa framsteg inom dessa områden. Omvänt, är användningen av skär kan bekräfta att signaltransduktion genom direkt cell-cellkontakt och inte genom utsöndrade faktorer. En av de viktigaste användningsområdena för insatser är i inflammations studier ^2-14 där effekten av utsöndrade cytokiner utvärderas i olika cellulära spelare av immunitet. I synnerhet har studier av inflammation i centrala nervsystemet (CNS) kraftigt nytta av insats co-kulturstudier, som har gjort det möjligt att bättre definiera olika parakrina roller neuroner och mikroglia driva neuroinflammation ^15-21. Dessa system var också utformas för att studera den antiinflammatoriska potentialen av molekyler som är beroende av deras förmåga att reducera eller inhibera sekretion av pro-inflammatoriska faktorer ^22-26. Forskning avseende cancer ^27-31, i synnerhet de mekanismer som ligger bakom angiogenes ^32-34 och inflammatipå ^35-42 i tumörbildning, också nytta av insats co-odlingssystem. Dessutom, lösliga faktorer är av största betydelse i de processer som driver differentieringen och flera studier har använt insatser för att svara på frågor i denna speciella fält ^43-50. I CNS, ser som nervvävnad har en mycket begränsad förnyelse potential, studiet av neurotrophism och neuroprotektion är grundläggande och har allmänt säkerställs genom användning av stamceller i samarbete odlingssystem ^51-56. Dessutom är skär också utnyttjas i så skilda områden som Nephrology ^57,58, endotelceller interaktioner och angiogenes ^59-62, apoptos signalering ^63-65, inflammation i fetma och metabola syndromet ^22,23,66-67, innerörat hår cellskyddet ^68,69, och även i svamp virulens ^70,71 och parasitologi ^72,73.

Den här artikeln innehåller allmänna metodologiska riktlinjer för att inrätta en experiment med hänsyn till utvärdering av cellförändringar som medieras av utsöndrade lösliga faktorer som använder en insats samodlingssystemet. Framför allt kommer vi att fokusera vår uppmärksamhet på nervcells co-kulturer och deras användning i att studera neuro process. Med tanke på den mycket brett spektrum av experiment som infogar göra det möjligt att piloten, är det outhärdligt att täcka varje aspekt av denna cellodlingsteknik. Som ett exempel, att ett särskilt protokoll mäta effekterna av cytokiner som utsöndras av lipopolysackarid (LPS) -activated N9 mikroglia på neuronala PC12-celler kommer att presenteras, som erbjuder en konkret förståelse av insats samodling metodik.

Protocol

NB: Vart och ett av följande steg bör utföras under sterila betingelser i ett dragskåp med laminärt flöde som krävs för däggdjurscellkultur. Dessutom de allmänna riktlinjerna för optimal steril cellodling tillämpas, till exempel., Kasta tips helst de kan leda till korskontaminering, minska mängden tids celler utsätts för luft när de utför hela medie förändringar ordentligt men försiktigt under omrörning cellsuspensioner för att säkerställa deras homogen pipettering, etc. Dessutom skär ?…

Representative Results

Användningen av skär co-odlingssystem är särskilt relevant i studien av neuroinflammatoriska processer som demonstrerar parakrina relationer mellan olika cellulära spelare i CNS. Immunitet i CNS främst åstadkommas genom bosatta celler som kallas mikroglia som övervakar deras miljö i sin vilande förgrenad tillstånd (figur 2A) och är kapabla att sensor störningar som kunde besvära mycket dyrbara homeostas nödvändig för korrekt neuronal funktion 76-78….

Discussion

Det mest kritiska steget i någon insert samodlingssystemet experiment faktiskt bor i att välja den korrekta insatsen att använda. Porstorlek och membranmaterialet måste tas till utförlig redogörelse, utan att glömma att överväga vilken typ av celler som kommer seedas och syftet med försöket. Exempelvis kan chemotaxic analyser använda samma typ av membran än cell samkulturer att analysera cellbeteende modulationer inducerade av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cellkontakt. Emellertid båda t…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum