Ekstern ekspression af neuroner ved hjælp af elektriske og magnetiske felter i en- og todimensionelle kulturer

Summary

Neuronale kulturer er en god model til at studere nye brain stimulation teknikker via deres effekt på enkelte neuroner eller en population af neuroner. Her præsenteres forskellige metoder til stimulering af mønstrede neuronale kulturer ved et elektrisk felt, der frembringes direkte af bad elektroder eller fremkaldt af en tidsvarierende magnetfelt.

Abstract

En neuron vil fyre et aktionspotentiale når dens membranpotentialet overstiger en vis tærskel. I typiske aktivitet i hjernen, dette sker som et resultat af kemiske input til sine synapser. Dog kan neuroner også ophidset af en pålagt elektrisk felt. Især de seneste kliniske anvendelser aktiverer neuroner ved at skabe et elektrisk felt eksternt. Det er derfor af interesse at undersøge, hvordan den neuron reagerer på det eksterne område og hvad der forårsager aktionspotentialet. Heldigvis, præcis og kontrolleret påføring af et ydre elektrisk felt er muligt for embryonale neuronale celler, som er udskåret, dissocieret og dyrkes i kulturer. Dette giver mulighed for undersøgelse af disse spørgsmål i en meget reproducerbar system.

I dette papir nogle af de teknikker, der anvendes til styret påføring af ydre elektrisk felt på neuronale kulturer gennemgås. Netværkene kan være enten en dimensionel, dvs. mønstrede i linear former eller lov til at vokse på hele substratets plan, og således todimensionale. Desuden kan excitationen skabes ved direkte anvendelse af elektrisk felt via elektroder nedsænket i fluidet (bad elektroder) eller ved at inducere det elektriske felt ved hjælp af fjernbetjeningen skabelse af magnetiske impulser.

Introduction

Samspillet mellem neuroner og eksterne elektriske felter har grundlæggende konsekvenser samt praktiske. Medens det er kendt siden de tider af Volta at et eksternt påført elektrisk felt kan excite væv, er de mekanismer, der er ansvarlige for produktionen af en resulterende virkningspotentiale i neuroner først for nylig begyndt at blive bragt i orden ^{1, 2, 3, 4.} Dette omfatter at finde svar på spørgsmål vedrørende den mekanisme, der forårsager depolarisering af membranpotentiale, rolle membranegenskaber og ionkanaler, og selv region i neuron, der imødekommer det elektriske felt ^{2, 5.} Terapeutisk neurostimulation ^{6, 7, 8, 9,} <supclass = "xref"> 10 metoder er særligt afhængig af disse oplysninger, som kan være afgørende for målretning de ramte områder og for forståelse af resultatet af terapien. En sådan forståelse kan også hjælpe med at udvikle behandlingsprotokoller og nye tilgange til stimulering af forskellige områder i hjernen.

Måling af interaktionen inden in vivo hjernen tilføjer en vigtig komponent til denne forståelse, men hæmmes af unøjagtighed og ringe styrbarhed af målinger inden kraniet. I modsætning hertil kan målinger i kulturer let udføres i høj volumen med høj præcision, fremragende signal til støj ydeevne og en høj grad af reproducerbarhed og kontrol. Anvendelse af kulturer en lang række af neuronale egenskaber af kollektive netværk adfærd kan belyses ^{11, 12, 13, 14,} </sup> ^{15, 16.} Ligeledes forventes denne velkontrolleret system højeffektive til at belyse den mekanisme, hvorved andre stimuleringsmetoder arbejde, for eksempel hvordan kanalåbning under optisk stimulering i optogenetically aktive neuroner ^{17, 18, 19} er ansvarlig for at skabe aktionspotentiale.

Her er fokus på at beskrive den udvikling og forståelse for værktøjer, der effektivt kan ophidse neuron via et eksternt elektrisk felt. I denne artikel beskriver vi fremstilling af todimensionale og endimensional mønstrede hippocampuskulturer, stimulering ved hjælp af forskellige konfigurationer og orientering af en direkte påtrykt elektrisk felt ved bad elektroder og endelig stimulering af todimensional og mønstrede endimensionale kulturer ved en tidsvarierende magnetfelt, som inducerer et elektrisk felt^{5, 20, 21.}

Protocol

Etik erklæring: Procedurer, der involverer håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra Weizmann Institute of Science, og det passende Israelsk lov. Den Weizmann Institute er akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC). Den Weizmann Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte denne undersøgelse, udført med hippocampusneuroner. 1. Fremstil…

Representative Results

Protokollen præsenteret tillader let mønsterdannelse af neuronale kulturer. Når den er kombineret med flere metoder vi udviklet til stimulering, det gør det muligt at foretage målinger af nogle iboende neuron egenskaber såsom Chronaxie og Rheobase 5, for at sammenligne egenskaberne af raske og syge neuroner 27, at finde optimale måder at stimulere kulturer som en funktion af deres struktur og mange flere nye tilgange. Nogle eks…

Discussion

1D mønstring er et vigtigt redskab, der kan anvendes til en lang række applikationer. For eksempel har vi anvendt 1D mønsterdannelse til at skabe logiske porte fra neuronale kulturer ²⁹ og mere for nylig at måle Chronaxie og Rheobase af rotte hippocampale neuroner ^5, og opbremsningen i signaludbredelseshastighed af affyringsaktivitet i Down syndrom hippocampale neuroner sammenlignet med den vildtype (WT) hippocampusneuroner ^27. Den foreslåede p…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4