La excitación externa de neuronas usando campos eléctricos y magnéticos en culturas de una y dos dimensiones

Summary

cultivos neuronales son un buen modelo para el estudio de las técnicas de estimulación del cerebro emergentes a través de su efecto sobre las neuronas individuales o una población de neuronas. Aquí se presentan los diferentes métodos para la estimulación de cultivos neuronales estampadas por un campo eléctrico producido directamente por los electrodos de baño o inducida por un campo magnético variable en el tiempo.

Abstract

Una neurona se disparará un potencial de acción cuando su potencial de membrana supera un cierto umbral. En actividad típica del cerebro, esto ocurre como resultado de insumos químicos a sus sinapsis. Sin embargo, las neuronas pueden también ser excitados por un campo eléctrico impuesto. En particular, las aplicaciones clínicas recientes activan las neuronas mediante la creación de un campo eléctrico externo. Por tanto, es de interés para investigar cómo la neurona responde al campo externo y lo que hace que el potencial de acción. Afortunadamente, la aplicación precisa y controlada de un campo eléctrico externo es posible para las células neuronales embrionarias que son extirpados, disociados y crecer en cultivos. Esto permite la investigación de estas preguntas en un sistema altamente reproducible.

En este trabajo algunas de las técnicas utilizadas para la aplicación controlada de campo eléctrico externo en cultivos neuronales se revisan. Las redes pueden ser de una sola dimensión, es decir, modelado en lineaformas R o dejaron crecer en todo el plano del sustrato, y por lo tanto de dos dimensiones. Además, la excitación puede ser creado por la aplicación directa de campo eléctrico a través de electrodos sumergidos en el fluido (electrodos de baño) o induciendo el campo eléctrico usando la creación remota de pulsos magnéticos.

Introduction

La interacción entre las neuronas y los campos eléctricos externos tiene implicaciones fundamentales, así como los prácticos. Aunque se conoce desde los tiempos de Volta que un campo eléctrico aplicado externamente puede excitar el tejido, los mecanismos responsables de la producción de un potencial de acción resultante en las neuronas sólo se están empezando recientemente a ser desenredado ^{1, 2, 3, 4.} Esto incluye la búsqueda de respuestas a las preguntas sobre el mecanismo que causa la despolarización del potencial de membrana, el papel de propiedades de la membrana y de los canales iónicos, e incluso la región en la neurona que responde al campo eléctrico ^{2, 5.} Therapeutic neuroestimulación ^{6, 7, 8, 9,} <supclass = "xref"> 10 metodologías son particularmente dependientes de esta información, que puede ser crucial para la definición de las zonas afectadas y para la comprensión de los resultados de la terapia. Tal entendimiento también puede ayudar en el desarrollo de protocolos de tratamiento y nuevos enfoques para la estimulación de diferentes áreas del cerebro.

La medición de la interacción dentro del cerebro in vivo añade un componente importante para esta comprensión, pero se ve obstaculizada por la imprecisión y baja capacidad de control de las mediciones dentro del cráneo. En contraste, las mediciones en cultivos fácilmente se pueden realizar en gran volumen con alta precisión, excelente señal al rendimiento de ruido y un alto grado de reproducibilidad y de control. Utilizando cultivos una gran variedad de propiedades neuronales del comportamiento de la red colectiva se puede elucidar ^{11, 12, 13, 14,} </sup> ^{15, 16.} Del mismo modo, se espera que este sistema bien controlado ser altamente eficiente en elucidar el mecanismo por el cual otros métodos de estimulación trabajo, por ejemplo cómo la apertura del canal durante la estimulación óptica en las neuronas optogenetically activas ^{17, 18, 19} es responsable de crear potencial de acción.

Aquí la atención se centra en describir el desarrollo y la comprensión de las herramientas que pueden excitar de manera eficiente la neurona a través de un campo eléctrico externo. En este trabajo se describe la preparación de dos dimensiones y unidimensional cultivos de hipocampo estampadas, la estimulación utilizando diferentes configuraciones y orientación de un campo eléctrico aplicado directamente por los electrodos de baño, y finalmente la estimulación de dos dimensiones y modelado culturas unidimensionales por una variable en el tiempo del campo magnético, que induce un campo eléctrico^{5, 20, 21.}

Protocol

Ética declaración: Los procedimientos que implican la manipulación de animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Ciencia Weizmann, y la ley israelí apropiado. El Instituto Weizmann está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC). El Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Weizmann aprobó este estudio, llevado a cabo con las neuronas del hipoc…

Representative Results

El protocolo presentado permite la fácil patrón de cultivos neuronales. Cuando se combina con varios métodos que hemos desarrollado para la estimulación, que permite hacer mediciones de algunas propiedades de las neuronas intrínsecas tales como cronaxia y Reobase 5, para comparar las propiedades de las neuronas sanas y enfermas 27, para encontrar formas óptimas para estimular las culturas como una función de su estructura y muc…

Discussion

patrón 1D es una herramienta importante que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, hemos utilizado 1D patrón para crear puertas lógicas a partir de cultivos neuronales ²⁹ y más recientemente para medir la cronaxia y Reobase de neuronas de hipocampo de rata ^5, y la ralentización de la velocidad de propagación de la señal de la actividad de disparo en Down neuronas síndrome del hipocampo en comparación con el de tipo salvaje (WT) neuronas …

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4