Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.
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Artigo de método
Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo da neuroplasticidade e alterações moleculares em comportamentos aprendidos está a mudar a partir do estudo de regiões do cérebro inteiro ao estudo de conjuntos específicos de neurônios ativados escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais que medeiam aprendidas associações. Fluorescência de células activadas (FACS) foi recentemente optimizada para o tecido do cérebro do rato adulto e permitiu o isolamento de neurónios activados utilizando anticorpos contra o marcador neuronal NeuN e proteínas Fos, um marcador de neurónios fortemente activado. Até agora, os neurónios que expressam-Fos e outros tipos de células foram isoladas a partir de tecido fresco, o que implicou dias longos de processamento e permitiu número muito limitado de amostras de cérebro de ser avaliadas após procedimentos comportamentais longas e complexas. Aqui descobrimos que os rendimentos de Fos-expressando neurônios e mRNA Fos de striatum dorsal foram semelhantes entre o tecido recém-dissecados e tecido congelado a -80 ºC durante 3 - 21 dias. Além disso, confirmou o fenótipodas células NeuN positivos e NeuN-negativas classificados por expressão avaliar gene de natureza neuronal (NeuN), astrócitos (GFAP), oligodendrocíticos (Oligo2) e microgial marcadores (Iba1), o que indica que o tecido congelado pode também ser utilizado para o isolamento de FACS de tipos de células gliais. Em geral, é possível recolher, dissecar e congelar o tecido cerebral para sessões múltiplas de FACS. Isto maximiza a quantidade de dados obtidos a partir de sujeitos animais valiosos que têm muitas vezes sido submetidos a procedimentos comportamentais longos e complexos.
Introdução
Durante o aprendizado, os animais formam associações entre conjuntos complexos de estímulos altamente específicos. Esta informação de alta resolução é pensado para ser codificado por alterações dentro dos padrões específicos de neurônios escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais. Conjuntos neuronais foram recentemente identificados pela indução de genes imediatamente precoces (IEGs), tais como Fos, arco, e Zif268 e seus produtos proteicos em neurónios que foram fortemente activadas durante o comportamento ou a exposição a estímulos. Fos-expressando neurônios, em particular, têm sido mostrados para desempenhar papéis causais no ....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) dos Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório 16.
Nota: Todos os passos abaixo uso tubos de ligação baixas centrífuga que foram mantidos em gelo, a menos que especificado em contrário.
1. Preparação antes da coleção Tissue
- Definir a centrífuga a 4 o C.
- Fogo polonês um conjunto de três pipetas Pasteur de vidro com decrescentes diâmetros de cerca de 1,3, 0,8, e 0,4 mm para cada amostra.
- Preparar 1,7 ml rotulados-tubos....
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Resultados
Classificando neurônios Fos-positivos e Fos-negativos de tecido dorsal striatum frescos e congelados de ratos individuais após as injeções de metanfetamina agudas.
O protocolo acima descrito foi utilizado para classificar os neurónios positivos e Fos-Fos-negativas a partir de um único rato estriado dorsal 90 minutos depois de uma injecção intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ratos ingênuos em suas gaiolas foram utiliz.......
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Discussão
FACS pode ser usado para classificar os neurónios e outro tipo de células a partir de qualquer tecido cerebral adulto fresca ou congelada. Como mencionado na introdução, a capacidade de usar tecido congelado permite uma utilização óptima das amostras de animais que tenham sido submetidos a procedimentos comportamentais complexas e prolongadas, como a auto-administração e de recaída estudos em pesquisa vício. Estes procedimentos comportamentais geralmente leva 1-2 horas ou mais tempo, e necessitam de todos os animais (10.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIDA (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. foi apoiado por uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa do NIDA patrocinado pelos Institutos Nacionais de Saúde e administrado pelo Instituto Oak Ridge de Ciência e Educação, e recebeu apoio financeiro adicional de uma bolsa de estudos Becas-Chile administrada pela CONICYT e pela Universidad de los Andes, Santiago, Chile. A instalação do Johns Hopkins FACS Core foi apoiada pelo Award P30AR053503 do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele do Instituto Nacional de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz cerebral | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | para obter fatias de cérebro coronal |
| Hibernar A baixa fluorescência | Brain Bits | HA-lf | Buffer A no protocolo é usado para processar tecidos e células da dissociação às etapas de fixação |
| Accutase | Millipore | SCR005 | A solução enzimática no protocolo é usada para digestão enzimática do tecido antes da trituração |
| Tubo de Proteína LoBind 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | para prevenir a perda de células durante o protocolo |
| Cell Strainer, 40 µ m | BD Falcon | 352340 | para filtrar a suspensão de células |
| Cell Strainer, 100 µ m | BD Falcon | 352360 | para filtrar a suspensão celular |
| Falcon Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 ml com tampa de pressão do filtro de células | BD Bioscience | 352235 | filtrar a suspensão celular antes de passar pelo citômetro de fluxo |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH fornece | 6640-00-782-6008 | para fazer trituração de tecidos |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (monoclonal de camundongo) | anticorpo EMD Millipore | FCMAB317PE | anticorpo para detectar neurônios |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Tecnologia de Sinalização Celular | 8677 | anticorpo para detectar células que expressam Fos |
| DAPI | Sigma | D8417 | para rotular núcleos |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | O kit inclui o tampão de extração de RNA para a etapa 6.14. É usado para coletar células classificadas |
| Superscript III sistema de síntese de cDNA de primeira fita | Invitrogen | 18080-051 | para sintetizar cDNA do RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | fazer pré-amplificação direcionada a partir do cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Biossistemas Aplicados. | 4444963 | fazer PCR usando sondas TaqMan |
| Fos TaqMan sonda | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | sonda TaqMan/primers |
| NeuN sonda TaqMan | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | para marcador de gene neuronal |
| NeuN Primer direto | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | para marcador de gene neuronal |
| NeuN Primer reverso | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | para marcador de gene neuronal |
| Gfap sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | sonda / primers TaqMan para marcador genético astrocityc |
| iba-1 sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | sonda / primers TaqMan para marcador genético de microglia |
| Gapdh< / em> sonda TaqMan | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | para referência/manutenção gene |
| Gapdh Primer direto | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | sequência de nucleotídeos para referência / manutenção gene |
| Gapdh< / em> Primer reverso | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | para referência/manutenção gene |
| Oligo2 sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | Sonda/primers TaqMan para marcador genético oligodendrocítico |
| Pipetador P1000 | Rainin | 17014382 | É referido como a pipeta com um grande diâmetro de ponta nas etapas 3.1 e 3.3 para trituração de tecido leve e na etapa 6.7 para ressuspender células |
| 7500 Sistema de PCR rápido em tempo real | Applied Biosystems. | 446985 | para PCR quantitativo |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | para classificação FACS |
Referências
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell ne....
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Reimpressões e permissões
