对于在液体线虫游泳行为的基于计算机的分析一个有效和简单的方法进行说明。该方法需要很少或几乎没有投资线虫实验室。所使用的硬件是标准的,并且该计算机软件的行为分析(CELEST)是一个开放源码之一。
解剖调节行为的神经元和神经肌肉电路仍然是生物学的一个重大挑战。该线虫已被证明是在帮助解决这一难题,从激励的技术方法,构建人脑连接组,实际上基本功能模式的具体分子司机脱落光了宝贵的模式生物。已在固体基质进行线虫的行为学研究的大部分。在液体中,动物表现出的行为模式,包括在一个范围在三维速度运动,以及局部的身体动作,如无前形状变化的后卷曲,这引入定量的新挑战。一个简单的程序的步骤,以及使用使线虫的高分辨率分析游泳行为的软件,这里提出。该软件名叫张玉华,将使用跟踪一个专门的电脑程序同时对多个动物,并提供C的新措施线虫液体(游泳)运动。这些措施大多是植根于动物的姿势和基于计算机视觉和模式识别用于数学,没有阈临界值计算需求。软件工具可以用来既在数百只动物从合并的小批量试验评估总体游泳实力和揭示新的表型,即使在充分表征的基因的突变体。的标本适乐时分析,制备简单,技术含量低,被科学界能够适应面广。因此此处所描述的计算方法的使用应有助于行为和行为电路中的线虫模型的更多的理解。
定义遗传学,表观遗传学,经验和环境的影响的行为是如何在现代生物学的一个重大挑战。操作简单,适合遗传模型,可以通过计算跟踪和测量可以实现这一目标作出重要贡献。该线虫就是这样的一个模式。本文的目的是演示线虫游泳运动如何可以跟踪和定量提取八与生物相关性新颖特征的信息。
线虫具有约2相对短的寿命- 3瓦特和大约4天在20℃ 的1,2-生殖周期。在标准的实验室培养,这种微小线虫生长在含线虫生长介质(NGM)培养皿正在流传着一种细菌的食物来源3,4。 WT N2动物琼脂填充板优雅正弦波积极动;他们改变移动鼠漫游时(食品求),住宅(浏览),或从餐(无效饱腹感静止期)回收ES 5。减值6或7-12岁还可以显着地改变上板的运动。
基因调节行为,长期保健或老化,可以功能特点,通过分析线虫的运动模式或运动。衡量长期保健方法之一是到老年人分为根据自己的平板上运动三大类( 如 A,B和C),剧烈体力活动是A类和麻痹是C类7,8,13。虽然这样的定性排序是揭示体质的差异是有用的,分类是没有明确的界限笼统,因而他们的得分是受实验者的偏见。
越来越多的纤夫有升高的客观性,复杂性,和C的分析精度线虫运动在固体培养基上14-18。 线虫在平板上运动主要是受限制的,其中该动物使得与媒体的固体表面接触的平面。 ( 线虫也可以通过从身体仍然与固体表面接触的其余部分的抬起头离开,定位体在多个平面诱导探索。然而,这种行为是不寻常的。)当放置在液体中,这线虫发起波动的运动,或游泳,比在固体表面的动物,具有更广泛的空间运动,速度和运动的深度更大范围,并与前从后移动不同年龄的发病率增加。由于体能和应对新环境的快速分析,实验者可以将动物个体成液滴和得分它的身体弯曲频率下的解剖范围。录像可以方便的游泳活力的现在和未来的刻痕动物。然而,手动方法限制了可被打进特征的数目,并完全约束在一次得分一只动物。
运动在液体比固体培养基上运动少了探讨。实际上,有一些是健壮和容易在实验室中实施以测量液体19-24运动几个软件选项。该软件张玉华( 线虫游泳测试)提供的,可提供数据(曲率分数)的议案8的特性直接相关的使用和数学为基础的措施简单; (在Restif 等人 8的特征和优点的详细描述)。此外,计算分析使表型特征是不可能的人眼的得分澄清。这里,体现这种分析方法的分辨率数据呈现和易于实现协议描述后续天书分析记录游泳试验。
作为模型系统的使用线虫的继续,由于其遗传延展性,实验易处理性和解剖学注释以细致详细地增加。例如, 线虫雌雄同体的神经元结构和连接清楚地映射出34-36,极大地方便了控制特定行为的特定神经元回路的调查。 302的神经元构成了成人雌雄同体的神经系统,其处理范围广泛的感觉输入到像运动基本行为输出。更复杂的男性的神经系统的结构也被描述37,使性别特异性电路加以处理。 37
线虫行为已被广泛地研究了含有固体培养基的标准培养板中。由于WT 线虫在可预见的正弦波琼脂填充板从移动,偏差整体格局可以通过眼睛进行检测和人工评分。这种方法,然而,是受实验者的标准,是劳动密集型的。硬件和软件工具,用于跟踪和测量线虫在固体培养基上运动删除的主观性偏差和允许大规模的研究,允许更多复杂的生物学问题加以解决。最近由谢弗实验室16创建的行为数据库的分析扩展和深度已与上板运动的计算系统来实现的一个很好的例子。
当WT 线虫放入液体,动物很快适应了新的环境运动,开始游泳。 线虫游泳利用运动的更大的范围比爬行和可以更不规则8。像张玉华软件旨在填补C.详细分析差距线虫液体,permi行为的那些不容易通过的未受助眼测定,或可以比手动得分更迅速地完成运动相关的参数拟合定量。在8硬H成个人可以处理多达200影片,1000〜记录每天。
软件定义游泳充当体能和行为进行了全面评估指纹参数。除了富集在液体线虫行为和它们的基础的分子途径的复杂的小面的理解,该软件可用于探索生物学的多个方面,包括药理学应答,老化,和不同的行为。这里介绍的,那发生在C的物理性能的量化变化概述线虫成年人随着年龄的增长是该软件的这种应用的一个例子(更详细的介绍,请参阅Restif 等8)。在老龄化的背景下,一些测量参数下降,而更为增加或没有在野生型一致地变化。趋势是由长寿突变体的计算轮廓证实,在很大程度上,和同年龄人群的优雅和坏几岁同伙的相对配置文件保存在统一的环境条件。该软件的高分辨率也可以揭示细微的表现型先前在广泛表征突变体( 例如, 年龄-1(hx546)在图1中)未知。
有描述的协议的几个特别关键的步骤。维护游泳环境应变片文化的一个恒定的温度环境,是游泳重复性重要的,所以实验者我们非常鼓励去煞费苦心,避免随意的温度变化。游泳媒体应在相同的温度下将板。同样地,仔细注意墨滴大小为游泳将有助于确保重现性。最后,谨慎的做法是在思考推进有关积累大量的视频文件的卸载。建议处理从视频采集计算机除了一个网站的图片。
利用这里提出供游泳分析软件的具有一定的局限性。首先,虽然程序可以同时跟踪多个动物,如果超过五只动物被联合分析,有一个增加的机会,该动物将在视频图像跨越彼此游泳。当程序不能明确地确定哪些动物是它,它审查这些数据帧。虽然此方案功能确保个别动物数据是高质量的,它限制了吞吐量。其次,图像应该还算干净,就是无灰尘,污迹和灯光刺眼,因为相关的信号也可以混淆图像分析。作为协议第2.1.1节,一个非常低的高科技投入,可以通过消除并发症的波动大大有助于图像捕捉注意到我Ñ环境照明是覆盖用深色布不允许环境光到达阶段舞台区。第三,该程序用于在成年阶段的动物进行了优化。低龄幼虫游泳速度非常快,有小的机构,这增加了程序错误。第四,一些软件利用MATLAB中,并且当存在版本升级和/或操作系统升级,一些程序链接可能会中断。目前,该软件对MATLAB 2015B和Mac OS版10.10进行了优化,但我们预计很快就会发布一个软件版本,反对这种变化更加健壮。最后,视频数据文件可以变得很大快,并且需要的存储空间被分配。
总之,这里介绍的是一种简单的方法,可以通过任何实验室容易地实现没有太多投资创建线虫游泳CELEST分析的影片。软件包的功能包括广泛的自动化,从通过跟踪分析,同时多动物跟踪,以及使用的数学基础( 即,曲率措施)对于大多数运动参数的定量。该软件是开源的,其代码和演示公开可作为Restif 等详细说明。 8。虽然该方案特点进行跟踪先进的计算机视觉分析,其他已发布跟踪系统( 例如 ,Greenblum 等人 ,2014年38),与这里介绍的软件的参数分析兼容。未来的改进将朝向的软件转换成一个更强大的包,不限制使用上面提到的操作系统(在材料的表也表示)的特定版本被引导。
The authors have nothing to disclose.
张玉华发展由美国国立卫生研究院的支持授予R21AG027513和U01AG045864。数据和一些简短的视频表示是改编自Restif 等。 (2014年)8,这是根据知识共享署名(CC BY)牌照http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/出版。我们感谢里卡多Laranjeiro稿件帮助。
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |