Genteknik av en okonventionell Jäst för förnybart biobränsle och biokemisk produktion

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica är en icke-patogen, dimorfa och strikt aeroba jästarter. På grund av dess utmärkande fysiologiska funktioner och metaboliska egenskaper, är denna okonventionella jäst inte bara en bra modell för att studera den grundläggande karaktären av svamp differentiering men är också en lovande mikrobiell plattform för biokemisk produktion och olika biotekniska tillämpningar, som kräver omfattande genetiska manipulationer. Dock genetiska manipulationer av Y. lipolytica har varit begränsad på grund av avsaknaden av en effektiv och stabil genetisk transformation system samt mycket höga hastigheter av icke-homolog rekombination som kan huvudsakligen hänföras till Ku70 genen. Här rapporterar vi en enkel och snabb protokoll för effektiv genetisk transformation och gendeletion i Y. lipolytica Po1g. Först, ett protokoll för effektiv omvandling av exogent DNA i Y. lipolytica Po1g bildades. Second, för att uppnå den förbättrade dubbel crossover homolog rekombination hastighet för ytterligare deletion av målgener ades Ku70 genen raderas genom transformering av en avbrottskassett som bär 1 kb homologiarmar. För det tredje, för att visa den förbättrade gendeletion effektivitet efter strykningen av Ku70 genen, raderade vi individuellt 11 mål gener som kodar alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas med användning av samma förfaranden på Ku70 knockout plattform stam. Det observerades att hastigheten för exakt homolog rekombination ökade avsevärt från mindre än 0,5% för radering av Ku70-genen i Po1g till 33% -71% för den enda gendeletion av de 11 mål gener i Po1g Ku70 Δ. En replikativ plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören och Cre / LoxP-systemet konstruerades, och selektionsmarkörgen i jästen knockout stammar var så småningom avlägsnas genom uttryck av Cre-rekombinas för att underlätta flera omgångar av targeted genetiska manipulationer. De resulterande enda gen deletionsmutanter har potentiella tillämpningar inom biobränsle och biokemisk produktion.

Introduction

Till skillnad från Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en okonventionell jäst kan växa i form av jäst eller mycel som svar på förändringar i miljöförhållanden ^1,2. Således kan detta dimorphic jäst användas som en bra modell för att studera svamp differentiering, morfogenes och taxonomi ^3,4,5. Det är allmänt betraktas som en säker (GRAS) jästarter, som ofta används för att tillverka en mängd olika livsmedelstillsatser som organiska syror, polyalkoholer, aromföreningar, emulgeringsmedel och ytaktiva ^6,7,8,9. Det är en obligat aerob och en välkänd olje jäst kan naturligtvis ackumulera lipider vid höga halter, det vill säga upp till 70% av celltorrvikt ^10. Det kan också utnyttja ett brett spektrum av kolkällor för tillväxt, inklusive olika typer av rester i avfallsresurser som näringsämnen ^11,12,13. Alla dessa unika funktioner gör Y. lipolytica mycket attraktivt förolika biotekniska tillämpningar.

Även om hela genomsekvens av Y. lipolytica har publicerats ^14,15, är genetisk manipulation av denna okonventionella jäst mer komplex än andra jästarter. För det första är transformation av denna jästarter mycket mindre effektiv på grund av frånvaron av en stabil och effektiv genetisk transformation systemet ^16,17. För det andra är arbetskrävande genomisk integrering av linjära expressionskassetter som vanligen används för uttryck av gener av intresse som ingen naturlig episomala plasmid systemet har hittats i denna jäst ^18. Tredje generation av genetiska knock-outs och knock-ins är begränsade eftersom genmålsökning effektivitet via exakt homolog rekombination i denna jäst är låg och de flesta integrationshändelser sker genom icke-homolog sammanfogning (NHEJ) ^19.

I denna studie rapporterar vi ett optimerat transformationsprotokoll för Y. lipolytica </em> Po1g-stam, som är lätt, snabb, effektiv och reproducerbar. För att öka frekvensen av exakt homolog rekombination, raderade vi Ku70-genen, som kodar för ett nyckelenzym i den NHEJ-vägen. Genom att använda den optimerade transformationsprotokoll och omvandla en linjär knockout kassett som innehåller flankerande homologiregioner av 1 kb, den Ku70 genen hos Y. lipolytica Po1g har tagits bort. Robust av denna gen radering metodik sedan visat genom att rikta alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas gener i Po1g Ku70 Δ stam. Det observerades att den Ku70 deletionsstam uppvisade en betydligt högre verkningsgrad av homolog rekombination förmedlad genmålsökning än den för vildtyp Po1g stam. Dessutom genomfördes ett replika Cre expression plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören tillverkat för att utföra markör räddning. Markören rädda underlättar flera omgångar av riktad genmodifiering i the erhållna genen deletionsmutanter. Förutom gendeletion, kan våra protokoll för genetisk transformation och gendeletion beskrivs här tillämpas för att infoga gener till specifika loci, och att införa platsspecifika mutationer i Y. lipolytica genomet.

Protocol

1. Generering av Y. lipolytica Ku70 deletionsstam Konstruktion av avbrottskassett Obs: Se tabell 1 för alla primers som används i polymeraskedjereaktion (PCR) förstärkningar. Konstruktions primrar 20 för att PCR-amplifiera LEU2-expressionskassett (se tabell 1) från en Y. lipolytica expressionsvektor och införa loxP-ställen i 5'- och 3'-ändarna av LEU2-kassett med en långsträckt främre …

Representative Results

Den linjäriserade Y. lipolytica expressionsvektor infördes i pBR dockningsplattform i genomet hos Y. lipolytica Po1g stammen genom att utföra en enda crossover rekombination 27. Genom att använda snabb kemisk omvandling förfarande som fastställs i denna studie, den linjäriserade Y. lipolytica uttryckningsvektor framgångsrikt transformeras in i vildtyp Po1g töjning vid en transformationseffektivitet av> 100 cfu / | ag DNA. En knockout kass…

Discussion

Vårt mål för denna studie är att möjliggöra snabb och effektiv generering av riktade gen knockouts i Y. lipolytica Po1g stam. Flera faktorer måste åtgärdas för att uppnå detta. För det första är en hög transformationseffektivitet krävs. Således, en effektiv och bekväm kemisk omvandling protokoll för Y. lipolytica Po1g stam beskrivs i denna studie. Användningen av PEG-4000 är en avgörande faktor för den lyckade omvandlingen av denna stam. Inga transformanter erhölls för…

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600