मानव मेलेनोमा के ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
पूर्व vivo के दत्तक हस्तांतरण का विस्तार ऑटोलॉगस ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) मेटास्टेटिक मेलेनोमा के साथ रोगियों की महत्वपूर्ण सबसेट में टिकाऊ और पूर्ण प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण के प्रमुख बाधाओं का तबादला टी कोशिकाओं, टेलोमेर छोटा करने की वजह से कम व्यवहार्यता हैं, और TILs की सीमित संख्या के रोगियों से प्राप्त की। लंबे टेलोमेयर के साथ कम से विभेदित टी कोशिकाओं दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए एक आदर्श टी सेल सबसेट हो सकता है, हालांकि, इन कम-भेदभाव टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा समस्याग्रस्त है। दत्तक टी सेल थेरेपी की इस सीमा सैद्धांतिक रूप से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग (IPSCs) द्वारा दूर किया जा सकता है कि स्वयं को नवीनीकृत, pluripotency, लम्बी है telomeres बनाए रखने, और प्रतिरक्षा के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत प्रदान करते हैं। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल TILs में reprogramming कारकों के पारगमन के लिए सेंडाइ वायरस वैक्टर का उपयोग IPSCs उत्पन्न करने के लिए उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल उत्पन्नपूरी तरह से reprogrammed, वेक्टर मुक्त क्लोन है। ये तिल व्युत्पन्न IPSCs दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए कम से भेदभाव कर रोगी और ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने में सक्षम हो सकता है।
Introduction
सेलुलर reprogramming प्रौद्योगिकी है कि प्रतिलेखन कारकों में से एक परिभाषित सेट की overexpression के माध्यम से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है सेल आधारित चिकित्सा 1,2 के क्षेत्र में काफी संभावनाएं हैं। ये IPSCs ट्रांसक्रिप्शनल और epigenetic सुविधाओं प्रदर्शन और आत्म नवीकरण और pluripotency के लिए क्षमता, वैसे ही भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) 3-5 कर दिया है। उल्लेखनीय पिछले एक दशक में reprogramming प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हुई प्रगति हमें इस तरह के टी कोशिकाओं 6-8 के रूप में टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं से भी मानव IPSCs उत्पन्न करने के लिए अनुमति दी गई है। टी सेल व्युत्पन्न IPSCs (TiPSCs) मूल टी कोशिकाओं के रूप में टी सेल रिसेप्टर (TCR) श्रृंखला जीन की ही पुन: व्यवस्थित विन्यास, जो TiPSCs 9-11 से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के उत्थान के लिए अनुमति देता बरकरार रहती है।
मेलेनोमा-घुसपैठ लिम्फोसाइटों का लगभग 80% (TILs) प्राप्त एक मरीज की ट्यूमर से विशेष रूप से समझते हैं ट्यूमर जुड़े एंटीजन एकएन डी मूल कैंसर की कोशिकाओं को 12 के खिलाफ cytotoxicity बनाए रखें। विशेष रूप से, TILs पर प्रोग्राम कोशिका मृत्यु प्रोटीन -1 (पीडी -1) की अभिव्यक्ति ऑटोलॉगस ट्यूमर प्रतिक्रियाशील प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए मिला था, उत्परिवर्तित neoantigen विशेष सीडी 8 + लिम्फोसाइटों 13 भी शामिल है। प्रारंभिक lymphodepleting परहेजों और इंटरल्यूकिन -2 (IL-2) के प्रणालीगत प्रशासन के साथ संयोजन में पूर्व vivo का विस्तार ऑटोलॉगस TILs के दत्तक हस्तांतरण रोगियों 14 के सबसेट में मेटास्टेटिक मेलेनोमा की पर्याप्त प्रतिगमन पैदा कर सकता है। preclinical मॉडल में और रोगियों में परिणाम उत्साहजनक के बावजूद, संचार टी कोशिकाओं की गरीब अस्तित्व और प्रतिरक्षा दमनकारी रास्ते के अस्तित्व को दत्तक टी सेल थेरेपी की पूरी क्षमता का समझौता करने के लिए दिखाई देते हैं। वर्तमान नैदानिक प्रोटोकॉल आदेश बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं की व्यापक पूर्व vivo में गड़बड़ी की आवश्यकता होती है। इस टर्मिनली विभेदित टी कोशिकाओं गरीब अस्तित्व है, कम prol की पीढ़ी में यह परिणामiferative क्षमता है, और पीडी -1 15 के उच्च स्तरों।
दत्तक टी सेल थेरेपी की इस सीमा सैद्धांतिक रूप से IPSCs कि प्रतिरक्षा के लिए ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत प्रदान कर सकते हैं का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। हमने हाल ही में सेंडाइ वायरस (सेव) चार प्रतिलेखन कारक की मध्यस्थता पारगमन, OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC 16 से पीडी -1 के उच्च स्तर व्यक्त मेलेनोमा TILs के reprogramming की सूचना है। जबकि रेट्रोवायरस वैक्टर मेजबान गुणसूत्रों में एकीकरण की आवश्यकता reprogramming जीन व्यक्त करने के लिए, सेव वैक्टर गैर एकीकृत कर रहे हैं और अंत में कोशिका द्रव्य से समाप्त हो जाते हैं। Reprogramming दक्षता ज्यादा lentivirus या रेट्रोवायरस वैक्टर 6-8 के साथ तुलना में एक सेव सिस्टम के साथ अधिक है। इसके अलावा, सेव विशेष रूप से, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) में टी कोशिकाओं reprogram कर सकते हैं कुछ IPSC lentivirus या रेट्रोवायरस वैक्टर द्वारा उत्पन्न क्लोन nonlymphoid प्रजातियों 6-8 से किया जा सकता है। यहाँ, हम विस्तारप्रक्रियाओं अलगाव और मानव मेलेनोमा TILs के सक्रियण के लिए और एक सेव reprogramming प्रणाली का उपयोग करते हुए तिल व्युत्पन्न IPSCs की पीढ़ी के लिए लागू किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम OCT3 / 4, Sox2, KLF4, और सी-MYC कारकों चार प्रतिलेखन के सेव की मध्यस्थता पारगमन द्वारा IPSCs को मेलेनोमा TILs reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। यह दृष्टिकोण, टी कोशिकाओं reprogram करने के लिए एक प्रणाली का उपयोग …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
