ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。
Introduction
転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs 9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。
患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞12に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 +リンパ球13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者14のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 15の高レベル。
養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 16によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法7の利点を提供します。
以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・シス…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
Referências
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