Isolering af sammenhørende RNA-protein-komplekser fra celler under anvendelse Oligonucleotid-rettet Eluering
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Posttranskriptionel genekspression præcist reguleret, begyndende med DNA-transkription i kernen. Kontrolleret af RNA-bindende proteiner (RBP'er), mRNA biogenese og metabolisme forekommer i meget dynamiske ribonucleoprotein partikler (RNP'er), der associerer og dissocierer med et substrat precursor mRNA under progressionen af RNA-metabolisme 1-3. Dynamiske ændringer i RNP komponenter påvirker post-transkriptionel skæbne en mRNA og giver kvalitetssikring under behandlingen af primære udskrifter, deres nukleare menneskehandel og lokalisering, deres aktivitet som mRNA skabeloner til oversættelse, og den endelige omsætning af modne mRNA.
Talrige proteiner betegnes som RBP'er i kraft af deres konserverede aminosyre-domæner, herunder RNA genkendelsesmotiv (RRM), det dobbeltstrengede RNA-bindende domæne (RBD), og strækninger af basiske rester (fx arginin, lysin og glycin) fire. RBP'er rutinemæssigtisoleres ved immunopræcipitationsanalyser strategier og screenes for at identificere deres beslægtede RNA. Nogle RBP'er co-regulere præ-mRNA, der er funktionelt beslægtede, udpeget som RNA reguloneme 5-8. Disse RBP'er, deres beslægtede mRNA, og nogle gange ikke-kodende RNA, danner katalytiske RNP'er, der varierer i sammensætning; deres unikhed skyldes forskellige kombinationer af forbundne faktorer, såvel som den tidsmæssige sekvens, placering og varigheden af deres vekselvirkninger 9.
RNA immunoprecipitation (RIP) er en kraftfuld teknik til at isolere RNP'er fra celler og til at finde associerede udskrifter ved hjælp af sekvensanalyse 10-13. Flytning fra kandidat til genome-wide screening er mulig gennem RIP kombineret med en microarray analyse 14 eller high-throughput sekventering (RNAseq) 15. Ligeledes kan co-udfælde proteiner identificeres ved massespektrometri, hvis de er tilstrækkeligt rigelige og adskilles fra co-fældning af antistof 16,17. Her har vi fat metoden til isolering af RNP komponenter i en specifik beslægtet RNA fra dyrkede humane celler, selv om tilgang er foranderlige for opløselige lysater af planteceller, svampe, vira og bakterier. Downstream analyser af materialet omfatter kandidat identifikation og validering ved immunoblot, massespektrometri, biokemisk enzymatisk assay, RT-qPCR, microarray, og RNAseq, som opsummeret i figur 1.
I betragtning af den grundlæggende rolle RNP'er kontrollere genekspression på post-transkriptionel niveau, at ændringer i ekspressionen af komponent RBP'er eller deres tilgængelighed beslægtede RNA kan være skadeligt for cellen og er forbundet med flere typer af lidelser, herunder neurologiske sygdomme 18. DHX9 / RNA-helicase A (RHA) er nødvendig til oversættelse af udvalgte mRNA af cellulære og retrovirale oprindelse 6. Disse beslægtede RNA udviser strukturelt relaterede cis-virkende elementer inden for deres5 'UTR, der er udpeget som den post-transkriptionel kontrol element (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet er nødvendig for en effektiv cap-afhængige oversættelse af mange retrovirus, herunder HIV-1, og af vækstregulerende gener, herunder Jund 6,20,21. Kodet af et essentielt gen (dhx9), RHA er afgørende for celledeling og dets nedregulering eliminerer cellernes levedygtighed 22. Den molekylære analyse af RHA-PCE RNP'er er et vigtigt skridt til at forstå, hvorfor RHA-PCE aktivitet er nødvendig for at kontrollere celledeling.
Den præcise karakterisering af RHA-PCE RNP komponenter ved steady state eller upon fysiologisk forstyrrelse af cellen kræver selektiv berigelse og fangst af RHA-PCE RNP'er i tilstrækkelig overflod for downstream analyse. Her blev retroviral PCEgag RNA mærket med 6 kopier af cis-agerende RNA bindingssted for MS2-kappeprotein (CP) inden for den åbne læseramme. MS2 coat protein blev exogenously co-udtrykkes med PCEgag RNA ved plasmidtransfektion at lette RNP forsamling i voksende celler. RNP'er indeholdende MS2-kappeprotein med beslægtet MS2-mærkede PCEgag RNA blev immunfældet fra cellen ekstrakt og indfanget på magnetiske perler (figur 2A). For selektivt fange RNP komponenter bundet til PCE, blev det immobiliserede RNP inkuberet med et oligonukleotid komplementært til sekvenser distalt til PCE, danner en RNA-DNA-hybrid, der er substrat for RNase H-aktivitet. Da PCE er positioneret i 5'-terminalen af 5'-utranslaterede region, oligonukleotidet var komplementært til RNA-sekvenser tilgrænsende til retrovirale translationsstartstedet (gag-startkodonen). RNase H-spaltning i nærheden af gag-startkodonen frigivet 5'-UTR kompleks fra det immobiliserede RNP, som blev opsamlet som elueringsmiddel. Derefter blev prøven evalueret med RT-PCR for at bekræfte fangst af PCEgag og ved SDS PAGE og immunblot at bekræfte capture af målet MS2-kappeprotein. En validering af PCE-associerede RNA-bindende protein, DHX9 / RNA-helicase A, blev derefter udført.
Protocol
Representative Results
Discussion
The RNP isolation and cognate RNA identification strategy described here is a selective means of investigating a specific RNA-protein interaction and of discovering candidate proteins co-regulating a specific RNP in cells.
The advantage of using oligonucleotide-directed RNase H cleavage to isolate RNPs is the ability to capture and specifically analyze the RNP cis-acting RNA element over heterogeneous RNPs bound downstream to the cis-acting RNA element of interest. Because the abundance of a c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge support by NIH P50GM103297, P30CA100730 and Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
