Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Post-transcriptionele genexpressie nauwkeurig geregeld, beginnend met DNA transcriptie in de kern. Gecontroleerd door RNA-bindende eiwitten (RBPs), mRNA biogenese en metabolisme optreden in hoogdynamische ribonucleoproteïnepartikels (RNP's), die associëren en dissociëren met een substraat precursor mRNA tijdens de progressie van RNA metabolisme 1-3. Dynamische veranderingen in RNP componenten beïnvloeden de post-transcriptionele lot van een mRNA en zorgt voor kwaliteitsborging tijdens de bewerking van primaire transcripten hun nucleaire handel en lokalisatie, hun activiteit als mRNA sjablonen voor translatie en de uiteindelijke omzet van rijpe mRNA.
Talrijke proteïnen worden aangeduid als RBPs vanwege hun geconserveerde aminozuur domeinen, zoals de RNA herkenningsmotief (RRM), de dubbelstrengs RNA-bindende domein (RBD) en stukken van basische residuen (bijvoorbeeld arginine, lysine en glycine) 4. RBPs zijn routinematiggeïsoleerd door immunoprecipitatie en strategieën worden gescreend om hun verwante RNAs identificeren. Sommige RBPs co-regulering pre-mRNA die functioneel gerelateerd, aangeduid als RNA regulonen 5-8. Deze RBPs hun cognate mRNA en soms niet-coderende RNA vormen katalytische RNP dat in samenstelling variëren; hun uniciteit komt door verschillende combinaties van geassocieerde factoren, alsmede de chronologische volgorde, locatie, en de duur van hun interacties 9.
RNA immunoprecipitatie (RIP) is een krachtige techniek om RNP's uit cellen te isoleren en geassocieerde transcripten middels sequentieanalyse 10-13 identificeren. Verhuizen van kandidaat om genoombrede screening haalbaar is door middel van RIP in combinatie met een microarray-analyse 14 of high-throughput sequencing (RNAseq) 15. Evenzo kan co precipiterende eiwitten worden geïdentificeerd door massaspectrometrie, of ze voldoende overvloedig en scheidbaar van de co-precipiterende antilichaam 16,17. Hierbij gaan we in de methode voor het isoleren van RNP componenten van een specifieke verwante RNA uit gekweekte menselijke cellen, maar de benadering veranderbaar voor oplosbare lysaten van plantencellen, schimmels, virussen en bacteriën. Stroomafwaarts analyses van het materiaal zijn onder andere kandidaat identificatie en validatie door immunoblot, massaspectrometrie, biochemische enzymatische test, RT-qPCR, microarray en RNAseq, zoals samengevat in figuur 1.
Gezien de fundamentele rol van RNP's in het reguleren van genexpressie op post-transcriptioneel niveau, veranderingen in de expressie van component RBPs of de toegang voor verwante RNA's kunnen schadelijk voor de cellen en zijn geassocieerd met verschillende soorten aandoeningen, waaronder neurologische ziekten 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) nodig voor de vertaling van bepaalde mRNAs van cellulaire en retrovirale oorsprong 6. Deze verwante RNA's vertonen structureel verwante cis-werkende elementen binnen hun5 'UTR, die wordt aangeduid als de post-transcriptionele controle element (PCE) 19. RHA-PCE activiteit voor de doeltreffende cap-afhankelijke translatie van vele retrovirussen, zoals HIV-1, en groeiregulerende genen, waaronder JUND 6,20,21. Gecodeerd door een essentieel gen (dhx9), RHA is essentieel voor celproliferatie en de neerwaartse regulatie elimineert cellevensvatbaarheid 22. De moleculaire analyse van RHA-PCE RNP is een essentiële stap voor het begrijpen waarom RHA-PCE activiteit noodzakelijk om celproliferatie te regelen.
De precieze karakterisering van de RHA-PCE RNP componenten bij steady state of bij fysiologische verstoring van de cel vereist de selectieve verrijking en de vangst van de RHA-PCE RNP's in voldoende overvloed voor downstream-analyse. Hier PCEgag retroviraal RNA werd gelabeld met 6 kopieën van de cis-werkende RNA-bindingsplaats voor het MS2 manteleiwit (CP) in het open leesraam. De MS2 manteleiwit werd exogenously co-uitgedrukt PCEgag RNA door plasmide transfectie aan de RNP assemblage in groeiende cellen te vergemakkelijken. RNP die het MS2 manteleiwit met cognate MS2-tag PCEgag RNA werden immunogeprecipiteerd uit het celextract en vastgelegd op magnetische korrels (Fig 2a). Selectief vangen de RNP componenten gebonden aan de PCE, werd het geïmmobiliseerde RNP geïncubeerd met een oligonucleotide complementair aan sequenties distaal van de PCE, die een RNA-DNA-hybride dat het substraat voor RNase H activiteit. Aangezien PCE is gelegen in het 5 'uiteinde van de 5' onvertaalde gebied, het oligonucleotide complementair is aan het RNA-sequenties naast de retrovirale translatie startplaats (gag startcodon). RNase H klieving bij de gag startcodon bezit de 5 'UTR van het geïmmobiliseerde complex RNP, die was verkregen als elutiemiddel. Daarna werd het monster geëvalueerd door RT-PCR voor de daarbij PCEgag en door SDS PAGE en immunoblot bevestigt het captu bevestigenre van de doelgroep MS2 manteleiwit. Een validatie van de PCE-geassocieerde RNA bindend eiwit, DHX9 / RNA helicase A, werd vervolgens uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De RNP isolatie en verwante RNA identificatiestrategie hier beschreven selectieve middel van onderzoek van een specifiek RNA-eiwit interactie en ontdekken kandidaateiwitten co-regulering een bepaald RNP in cellen.
Het voordeel van het gebruik van oligonucleotide-gerichte RNase H klieving om RNP te isoleren is de mogelijkheid te vangen en specifiek wat de RNP-cis- werkende RNA-element over heterogene RNP stroomafwaarts gebonden aan het cis-werkende RNA-element plaats. Vanwege de overvloed van…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs dankbaar steun van NIH P50GM103297, P30CA100730 en Comprehensive Cancer P01CA16058 erkennen.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
