Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Posttranskriptionale Genexpression ist genau geregelt, mit DNA-Transkription im Zellkern beginnt. Gesteuert durch RNA – Proteine (RBPs) Bindung, mRNA Biogenese und Stoffwechsel auftreten in hochdynamischen Ribonukleoproteinpartikel (RNPs), die Gesellschafter und distanziere mit einem Substrat – Vorläufer – mRNA während der Progression von RNA – Metabolismus 1-3. Dynamische Veränderungen in RNP-Komponenten beeinflussen die posttranskriptionales Schicksal einer mRNA und bieten Qualitätssicherung bei der Verarbeitung von primären Transkripte, deren Kernhandel und Lokalisierung, ihre Tätigkeit als mRNA-Vorlagen für die Übersetzung und die eventuelle Umsatz von reifen mRNAs.
Zahlreiche Proteine werden als RBPs aufgrund ihrer konservierten Aminosäuredomänen bezeichnet, einschließlich des RNA – Erkennungsmotiv (RRM), das doppelsträngige RNA – Bindungsdomäne (RBD), und erstreckt sich von basischen Resten (beispielsweise Arginin, Lysin und Glycin) 4. RBPs sind routinemßigisoliert durch Immunpräzipitation Strategien und gesiebt, um ihre spezifischen RNAs identifizieren. Einige RBPs co regulieren pre-mRNAs , die funktionell verwandt sind, bezeichnet als RNA Regulons 5-8. Diese RBPs, ihre zugehörigen mRNAs, und manchmal nicht-kodierenden RNA bilden katalytische RNPs, die in ihrer Zusammensetzung variieren; ihre Einzigartigkeit ist auf verschiedene Kombinationen von zugeordneten Faktoren sowie der zeitlichen Abfolge, die Lage und Dauer ihrer Wechselwirkungen 9.
RNA Immunpräzipitation (RIP) ist ein leistungsfähiges Verfahren RNPs aus Zellen zu isolieren und zu 10-13 assoziierten Transkripte unter Verwendung von Sequenzanalyse identifiziert werden . Der Umzug von Kandidaten zu genomweite Screening möglich durch RIP ist mit einem Microarray – Analyse 14 oder Hochdurchsatz – Sequenzierung (RNA-Seq) 15 kombiniert. Ebenso Mitfällung Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden können, wenn sie ausreichend reichlich vorhanden und trennbar von dem Co-Ausfällen Antikörper 16 sind,17. Hier sprechen wir die Methodik für RNP Komponenten einer spezifischen kognaten RNA aus kultivierten menschlichen Zellen zu isolieren, obwohl der Ansatz für lösliche Lysate von Pflanzenzellen änderbaren ist, Pilze, Viren und Bakterien. Downstream – Analysen des Materials umfassen Kandidaten Identifizierung und Validierung durch Immunoblot, Massenspektrometrie, biochemische enzymatische Assays RT-qPCR, Microarray, und RNA-Seq, wie in Abbildung 1 zusammengefasst.
In Anbetracht der grundlegenden Rolle der RNPs bei der Kontrolle der Genexpression in der post-transkriptioneller Ebene, Veränderungen in der Expression der Komponente RBPs oder deren Zugänglichkeit zu stammverwandt RNAs für die Zelle schädlich sein können und mit verschiedenen Arten von Störungen in Verbindung gebracht, darunter neurologische Krankheit 18. DHX9 / RNA – Helikase A (RHA) ist , die für die Übersetzung der ausgewählten mRNAs von zellulären und retroviralen Ursprungs 6. Diese verwandtes RNAs zeigen strukturell verwandten cis-wirkende Elemente innerhalb ihrer5 'UTR, die als posttranskriptionelles Steuerungselement (PCE) 19 bezeichnet wird. RHA-PCE – Aktivität ist für die effiziente cap-abhängige Translation von vielen Retroviren, einschließlich HIV-1 und von wachstumsregulierenden Genen, einschließlich JUND 6,20,21. Codierte durch ein essentielles Gen (dhx9), ist RHA wesentlich für die Zellproliferation und die Herunterregulierung beseitigt die Lebensfähigkeit der Zellen 22. Die molekulare Analyse von RHA-PCE RNPs ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis, warum RHA-PCE-Aktivität ist notwendig, die Zellproliferation zu steuern.
Die genaue Charakterisierung der RHA-PCE RNP Komponenten im stationären Zustand oder auf physiologische Störung der Zelle erfordert die selektive Anreicherung und Erfassung der RHA-PCE RNPs in ausreichender Menge für Downstream-Analyse. Hier retroviralen PCEgag RNA wurde mit 6 Kopien des cis-aktiven RNA-Bindungsstelle für das MS2-Hüllprotein (CP) innerhalb des offenen Leserahmens markiert. Der MS2-Hüllprotein wurde exogenously coexprimiert mit PCEgag RNA durch Plasmid-Transfektion die RNP Anordnung in wachsenden Zellen zu erleichtern. RNPs das MS2 – Hüllprotein mit kognaten MS2-tagged PCEgag RNA enthielten , wurden aus dem Zellextrakt und erfasst auf Magnetkügelchen (Figur 2a) immunpräzipitiert. Um selektiv die RNP-Komponenten erfassen zu dem PCE gebunden wurde das immobilisierte RNP mit einem Oligonucleotid distal der PCE komplementär zu Sequenzen inkubiert, ein RNA-DNA-Hybrid bildet, die das Substrat für RNase-H-Aktivität ist. Da PCE in der "Klemme des 5'5 positioniert ist untranslatierten Region, war das Oligonukleotid komplementär zu den RNA-Sequenzen benachbart zu dem retroviralen Translationsstartstelle (gag-Startcodons). RNase H-Spaltung in der Nähe des gag-Startcodons freigegeben die 5'-UTR-Komplexes aus dem immobilisierten RNP, die als Eluent gesammelt. Danach wurde die Probe mittels RT-PCR ausgewertet, um die Erfassung von PCEgag und durch SDS-PAGE und Immunoblot zur Bestätigung der captu zu bestätigenre des Ziel MS2-Hüllprotein. Eine Validierung der PCE-assoziierten RNA-Bindungsprotein, DHX9 / RNA-Helikase A, wurde dann durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die RNP Isolierung und artverwandten RNA Identifizierung hier beschriebene Strategie ist ein selektiver mittels eines spezifischen RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen und Kandidatenproteine Co-Regulierung in den Zellen einen bestimmten RNP zu entdecken.
Der Vorteil der Verwendung von Oligonucleotid-gerichtete RNase H-Spaltung RNPs zu isolieren, ist die Fähigkeit, die RNP cis-wirkende RNA-Element über heterogene RNPs stromabwärts des cis-wirkende RNA-Element von Interesse gebun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Unterstützung durch die NIH P50GM103297, P30CA100730 und Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
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