Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
पोस्ट-transcriptional जीन अभिव्यक्ति ठीक नियंत्रित किया जाता है, नाभिक में डीएनए प्रतिलेखन के साथ शुरुआत की। आरएनए बंधनकारी प्रोटीन (RBPs) द्वारा नियंत्रित, mRNA जीवजनन और चयापचय को अत्यधिक गतिशील ribonucleoprotein कणों (RNPs) है, जो सहयोगी और एक सब्सट्रेट अग्रदूत mRNA के साथ शाही सेना चयापचय 1-3 की प्रगति के दौरान अलग कर देना में होते हैं। RNP घटकों में गतिशील परिवर्तन एक mRNA के बाद ट्रांसक्रिप्शनल भाग्य को प्रभावित और प्राथमिक टेप, अपने परमाणु तस्करी और स्थानीयकरण, अनुवाद के लिए mRNA टेम्पलेट्स के रूप में उनकी गतिविधियों, और परिपक्व mRNAs के अंतिम कारोबार के प्रसंस्करण के दौरान गुणवत्ता आश्वासन प्रदान करते हैं।
कई प्रोटीन आरएनए मान्यता मूल भाव (RRM) सहित उनके संरक्षित एमिनो एसिड डोमेन के आधार पर RBPs के रूप में नामित कर रहे हैं, डबल असहाय शाही सेना बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी), और बुनियादी अवशेषों के हिस्सों (जैसे, arginine, लाइसिन, और ग्लाइसिन) 4। RBPs नियमित तौर पर कर रहे हैंimmunoprecipitation रणनीतियों से अलग है और उनके आत्मीय RNAs की पहचान के लिए जांच कर रहे हैं। कुछ RBPs सह विनियमित पूर्व mRNAs कि कार्यात्मक-से संबंधित हैं, आरएनए regulons 5-8 के रूप में नामित। ये RBPs, उनके आत्मीय mRNAs, और कभी कभी गैर-कोडिंग आरएनए, उत्प्रेरक RNPs कि संरचना में भिन्नता फार्म; अपनी विशिष्टता की वजह से संबद्ध कारकों के विभिन्न संयोजनों के लिए, साथ ही अस्थायी अनुक्रम, स्थान, और उनकी बातचीत 9 की अवधि के लिए है।
आरएनए immunoprecipitation (आरआईपी) कोशिकाओं से RNPs अलग-थलग करने और अनुक्रम विश्लेषण 10-13 का उपयोग कर संबंधित टेप की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। उम्मीदवार से आगे बढ़ते जीनोम चौड़ा करने के लिए स्क्रीनिंग एक माइक्रोएरे विश्लेषण 14 या उच्च throughput अनुक्रमण (RNAseq) 15 के साथ संयुक्त चीर के माध्यम से संभव है। इसी तरह, सह precipitating प्रोटीन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहचाना जा सकता है अगर वे पर्याप्त प्रचुर मात्रा में और सह precipitating एंटीबॉडी 16 से वियोज्य हैं,17। यहाँ, हम सभ्य मानव कोशिकाओं से एक विशिष्ट आत्मीय शाही सेना के RNP घटकों को अलग-थलग करने की पद्धति को संबोधित है, हालांकि दृष्टिकोण संयंत्र कोशिकाओं, कवक, वायरस और बैक्टीरिया के घुलनशील lysates के लिए परिवर्तनीय है। चित्रा 1 में संक्षेप के रूप में सामग्री के बहाव के विश्लेषण के उम्मीदवार की पहचान और मान्यता immunoblot द्वारा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, जैव रासायनिक एंजाइमी परख, आर टी-qPCR, माइक्रोएरे, और RNAseq शामिल हैं।
पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में RNPs की मौलिक भूमिका को देखते हुए, घटक RBPs या उनकी पहुंच की अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए आत्मीय RNAs सेल के लिए हानिकारक हो सकता है और तंत्रिका संबंधी रोग 18 सहित विकारों के कई प्रकार, के साथ जुड़े रहे हैं। DHX9 / आरएनए helicase एक (RHA) सेलुलर और रेट्रोवायरल मूल 6 के चयनित mRNAs के अनुवाद के लिए आवश्यक है। ये आत्मीय RNAs भीतर संरचनात्मक रूप से संबंधित सीआईएस से अभिनय तत्वों का प्रदर्शन उनकी5 'UTR, जो बाद के transcriptional नियंत्रण तत्व (PCE) 19 के रूप में नामित किया गया है। RHA-PCE गतिविधि एचआईवी -1 सहित कई रेट्रोवायरस, के कुशल टोपी पर निर्भर अनुवाद के लिए आवश्यक है, और Jund 6,20,21 सहित विकास नियामक जीन, के। एक आवश्यक जीन (dhx9) द्वारा इनकोडिंग, RHA सेल प्रसार और इसके नीचे विनियमन के लिए आवश्यक है सेल व्यवहार्यता 22 को समाप्त। RHA-PCE RNPs की आणविक विश्लेषण समझ क्यों RHA-PCE गतिविधि सेल प्रसार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है के लिए एक आवश्यक कदम है।
स्थिर अवस्था में या सेल के शारीरिक गड़बड़ी पर RHA-PCE RNP घटकों के सटीक लक्षण वर्णन नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त बहुतायत में चयनात्मक संवर्धन और RHA-PCE RNPs का कब्जा की आवश्यकता है। इधर, रेट्रोवायरल PCEgag आरएनए MS2 कोट प्रोटीन (सीपी) खुला पढ़ने के लिए सीमा के भीतर सीआईएस से अभिनय आरएनए बाध्यकारी साइट के 6 प्रतियों के साथ टैग किया गया। MS2 कोट प्रोटीन exo थाgenously सह व्यक्त प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा PCEgag शाही सेना के साथ बढ़ कोशिकाओं में RNP विधानसभा की सुविधा के लिए। आत्मीय MS2 टैग PCEgag शाही सेना के साथ MS2 कोट प्रोटीन युक्त RNPs सेल निकालने से immunoprecipitated और चुंबकीय मोती (चित्रा 2A) पर कब्जा कर लिया गया। चुनिंदा RNP घटकों PCE के लिए बाध्य कब्जा करने के लिए, स्थिर RNP एक oligonucleotide PCE के लिए बाहर के दृश्यों के पूरक के साथ incubated किया गया था, एक शाही सेना डीएनए संकर RNase एच गतिविधि के लिए सब्सट्रेट है कि बनाने। चूंकि PCE untranslated क्षेत्र 5 '5 के टर्मिनल' में तैनात है, oligonucleotide रेट्रोवायरल अनुवाद शुरू साइट (झूठ शुरुआत कोडोन) से सटे आरएनए दृश्यों के लिए पूरक था। RNase एच स्थिर RNP, जो eluent के रूप में एकत्र किया गया था से रिहा 5 'UTR जटिल कोडोन झूठ शुरुआत के पास दरार। इसके बाद, नमूना आरटी पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया था captu पुष्टि करने के लिए PCEgag की और एसडीएस पृष्ठ और immunoblot द्वारा कब्जा पुष्टि करने के लिएलक्ष्य MS2 कोट प्रोटीन की पुन। PCE जुड़े आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन की एक मान्यता, DHX9 / आरएनए helicase ए, तो प्रदर्शन किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
RNP अलगाव और आत्मीय आरएनए पहचान रणनीति यहाँ वर्णित एक विशिष्ट आरएनए प्रोटीन बातचीत की जांच की और सह-विनियमन के उम्मीदवार प्रोटीन की खोज की कोशिकाओं में एक विशिष्ट RNP के एक चयनात्मक साधन है।
oligonu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृतज्ञता एनआईएच P50GM103297, P30CA100730 और व्यापक कैंसर P01CA16058 द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं।
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
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