Isolering av beslektede RNA-proteinkomplekser fra celler under anvendelse av oligonukleotid-rettet Eluering
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Post-transkripsjonell genekspresjon reguleres nøyaktig, som begynner med DNA-transkripsjon i kjernen. Kontrollert av RNA bindende proteiner (RBPs), mRNA biogenesis og metabolisme forekommer i svært dynamiske ribonucleoprotein partikler (RNPs), som førsteamanuensis og dissosierer med et substrat forløper mRNA under utviklingen av RNA metabolisme 1-3. Dynamiske endringer i RNP komponentene påvirker post-transcriptional skjebnen til et mRNA og gi kvalitetssikring under behandlingen av primære transkripsjoner, deres kjernefysisk trafficking og lokalisering, deres aktivitet som mRNA maler for oversettelse, og eventuell omsetning av modne mRNA.
Tallrike proteiner er betegnet som RBPs i kraft av sine konserverte aminosyrer domener, herunder RNA gjenkjennelse motiv (RRM), den dobbelt-trådet RNA-bindende domene (RBD), og strekninger av basiske rester (for eksempel, arginin, lysin og glycin) 4. RBPs er rutinemessigisolert av immunoutfellingsstudier strategier og er skjermet for å identifisere sine beslektede RNA. Noen RBPs co-regulere pre-mRNA som er funksjonelt-relatert, utpekt som RNA regulons 5-8. Disse RBPs, deres beslektede mRNA, og noen ganger ikke-kodende RNA, danner katalytiske RNPs som varierer i sammensetning; deres egenart er på grunn av ulike kombinasjoner av tilknyttede faktorer, så vel som til den timelige sekvens, plassering, og varigheten av deres samhandling 9.
RNA immunoprecipitation (RIP) er en kraftfull teknikk for å isolere RNPs fra celler og for å identifisere tilhørende utskrifter ved hjelp av sekvensanalyse 10-13. Flytting fra kandidat til genom-wide screening er mulig gjennom RIP kombinert med en microarray analyse 14 eller high-throughput sekvensering (RNAseq) 15. Likeledes kan ko-utfelling av proteiner bli identifisert ved massespektrometri, hvis de er tilstrekkelig mange og kan skilles fra den ko-utfelling av antistoff 16,17. Her tar vi metoden for isolering av RNP komponenter av et spesifikt beslektet RNA fra dyrkede humane celler, selv om tilnærmingen er modifiserbar for løselige lysater av planteceller, sopp, virus og bakterier. Nedstrøms analyser av materialet inkluderer kandidat identifisering og validering av immunoblot, massespektrometri, biokjemiske enzymatisk analyse, RT-qPCR, mikromatriser, og RNAseq, som oppsummert i figur 1.
Med den grunnleggende rolle RNPs i å kontrollere genekspresjon på det post-transkripsjonelle nivå, til endringer i ekspresjonen av komponent RBPs eller deres tilgjengeligheten beslektede RNA kan være skadelig for cellen og er forbundet med flere typer lidelser, inkludert nevrologiske sykdommer 18. DHX9 / RNA helicase A (RHF) er nødvendig for oversettelse av utvalgte mRNA av cellulære og retrovirale opprinnelse 6. Disse beslektede RNA vise strukturelt-relaterte cis-virkende elementer innen sitt5 'UTR, som er utpekt som den post-transkripsjonen kontroll element (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet er nødvendig for effektiv cap-avhengig translasjon av mange retrovirus, inkludert HIV-1, og av vekst regulatoriske gener, inkludert JUND 6,20,21. Kodet av et essensielt gen (dhx9), er RHA avgjørende for celleproliferasjon og dens nedregulering eliminerer cellelevedyktighet 22. Den molekylære analyser av RHA-PCE RNPs er et viktig skritt for å forstå hvorfor RHA-PCE aktivitet er nødvendig for å kontrollere cellevekst.
Den nøyaktige karakterisering av RHA-PCE RNP komponenter ved steady state eller ved fysiologisk forstyrrelse av cellen krever selektiv berikelse og fangst av RHA-PCE RNPs i tilstrekkelig mengde for nedstrøms analyse. Her ble det retrovirale PCEgag RNA merket med 6 kopier av cis-virkende RNA bindingssete for MS2-kappeprotein (CP) innenfor den åpne leserammen. MS2 kappeprotein ble exogenously co-uttrykkes med PCEgag RNA ved plasmid transfeksjon å lette RNP forsamlingen i voksende celler. RNPs inneholder MS2 kappeproteinet med beslektet MS2-merket PCEgag RNA ble immunopresipitert fra celleekstrakt og fanget på magnetiske kuler (figur 2a). For selektivt å fange opp de RNP komponentene bundet til PCE, ble den immobiliserte RNP inkubert med et oligonukleotid komplementære til sekvenser distale til den PCE, danner en RNA-DNA-hybrid som er substratet for RNase H-aktivitet. Siden PCE er plassert i 5'-terminalen til den 5 'utranslaterte region, oligonukleotidet var komplementære med RNA-sekvenser som grenser til den retrovirale translasjonsstartsetet (gag startkodonet). RNase H spaltning nær gag startkodonet utgitt 5'-UTR-komplekset fra den immobiliserte RNP, som ble oppsamlet som elueringsmiddel. Deretter ble prøven bedømt ved hjelp av RT-PCR for å bekrefte fangst av PCEgag og ved SDS-PAGE og immunoblot for å bekrefte capture av målet MS2-kappeproteinet. En validering av PCE-assosierte RNA-bindende protein, DHX9 / RNA helikase A, ble deretter utført.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNP isolasjon og beslektet RNA identifikasjon strategi er beskrevet her er en selektiv måte å undersøke et spesifikt RNA-protein interaksjon og oppdage kandidat proteiner co-regulere en spesifikk RNP i cellene.
Fordelen ved å bruke oligonukleotid-rettede RNase H spaltning for å isolere RNPs er evnen til å registrere og analysere spesifikt RNP cis-virkende RNA elementet over heterogene RNPs bundet nedstrøms til cis-virkende element RNA av interesse. På grunn av at overflod av en besle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke for støtten ved NIH P50GM103297, P30CA100730 og Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
