El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
la expresión del gen post-transcripcional se regula con precisión, a partir de la transcripción del ADN en el núcleo. Controlado por ARN de unión a proteínas (prácticas comerciales restrictivas), ARNm biogénesis y el metabolismo se producen en partículas de ribonucleoproteínas altamente dinámicas (RNPs), que se asocian y se disocian con un mRNA precursor sustrato durante la progresión de ARN metabolismo 1-3. Los cambios dinámicos en los componentes de RNP afectan el destino post-transcripcional de un ARNm y proporcionan garantía de calidad durante el procesamiento de los transcritos primarios, su tráfico nuclear y localización, su actividad como plantillas de ARNm para la traducción, y la eventual facturación de mRNAs maduros.
Numerosas proteínas se designan como las prácticas comerciales restrictivas en virtud de sus dominios de aminoácidos conservados, incluyendo el motivo de reconocimiento de ARN (RRM), el ARN de doble cadena dominio de unión (RBD), y tramos de residuos básicos (por ejemplo, arginina, lisina y glicina) 4. Las prácticas comerciales restrictivas son rutinariamenteaislado por las estrategias de inmunoprecipitación y se criban para identificar sus afines ARN. Algunas prácticas comerciales restrictivas co-regulan los pre-ARNm que están relacionadas funcionalmente, designados como regulons ARN 5-8. Estas prácticas comerciales restrictivas, sus ARNm afines, ya veces no codificante del ARN, forman RNP catalíticos que varían en su composición; su singularidad se debe a varias combinaciones de factores asociados, así como a la secuencia temporal, la ubicación, y la duración de sus interacciones 9.
RNA inmunoprecipitación (RIP) es una técnica poderosa para aislar RNPs procedentes de células y para identificar las transcripciones asociadas utilizando el análisis de secuencia de 10 a 13. Pasar de la candidata a escala del genoma de cribado es posible a través de PIR, junto con un análisis de microarrays 14 o secuenciación de alto rendimiento (RNAseq) 15. Del mismo modo, las proteínas co-precipitación se pueden identificar mediante espectrometría de masas, si son lo suficientemente abundante y separable del anticuerpo co-precipitación de 16,17. Aquí, nos dirigimos a la metodología para el aislamiento de componentes RNP de un ARN cognado específico a partir de células humanas cultivadas, aunque el enfoque es alterable por lisados solubles de células de plantas, hongos, virus y bacterias. Los análisis de aguas abajo de la materia incluyen la identificación y validación candidato por inmunoblot, espectrometría de masas, ensayo enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarrays, y RNAseq, tal como se resume en la Figura 1.
Dado el papel fundamental de la RNP en el control de la expresión génica a nivel post-transcripcional, las alteraciones en la expresión de las prácticas comerciales restrictivas de componentes o su accesibilidad a los afines ARN pueden ser perjudiciales para la célula y están asociados con varios tipos de trastornos, incluyendo la enfermedad neurológica 18. DHX9 / RNA helicasa A (RHA) es necesario para la traducción de mRNAs seleccionadas de orígenes celulares y retrovirales 6. Estos ARN afines exhiben elementos que actúan en cis-estructuralmente relacionadas dentro de su5 'UTR, que se designa como el elemento de control post-transcripcional (PCE) 19. Actividad RHA-PCE es necesario para la traducción en la tapa que dependen eficiente de muchos retrovirus, incluido el VIH-1, y de genes reguladores de crecimiento, incluyendo Jund 6,20,21. Codificada por un gen esencial (dhx9), RHA es esencial para la proliferación celular y su baja regulación elimina la viabilidad celular 22. El análisis molecular de RHA-PCE RNP es un paso esencial para entender por qué es necesaria la actividad de RHA-PCE para el control de la proliferación celular.
La caracterización precisa de los componentes RNP RHA-PCE en estado estacionario o sobre perturbación fisiológica de la célula requiere el enriquecimiento selectivo y captura de los RNPs RHA-PCE en abundancia suficiente para el análisis de aguas abajo. Aquí, el ARN retroviral PCEgag fue etiquetado con 6 copias del sitio de unión de ARN que actúa en cis para la proteína de cubierta de MS2 (CP) dentro del marco de lectura abierto. La proteína de cubierta de MS2 se exogenously co-expresada con PCEgag RNA por el plásmido de transfección para facilitar el montaje RNP en células en crecimiento. RNPs que contienen la proteína de cubierta MS2 con RNA etiquetado PCEgag-MS2 cognado se inmunoprecipitaron a partir del extracto celular y capturaron en perlas magnéticas (Figura 2a). Para capturar selectivamente los componentes RNP con destino al PCE, la RNP inmovilizado se incubó con un oligonucleótido complementario a las secuencias distales a la PCE, formando un híbrido de ARN-ADN que es el sustrato para la actividad de RNasa H. Desde PCE se posiciona en 'terminal del 5' de la región no traducida 5, el oligonucleótido era complementario a las secuencias de ARN adyacentes al sitio de inicio de traducción retroviral (gag codón de inicio). Escisión por RNasa H cerca del inicio de la mordaza codón lanzado complejo UTR 5 'de la RNP inmovilizado, que se recogió como eluyente. A partir de entonces, la muestra se evaluó mediante RT-PCR para confirmar la captura de PCEgag y mediante SDS PAGE y de inmunotransferencia para confirmar la capture de la proteína de cubierta de MS2 objetivo. Una validación de la unión de ARN proteína PCE-asociado, DHX9 / RNA helicasa A, se realiza entonces.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento RNP y estrategia de identificación afines ARN descrito aquí es un medio selectivo de la investigación de una interacción específica de ARN-proteína y de descubrimiento de las proteínas candidatas co-regulación de un RNP específico en las células.
La ventaja de usar oligonucleótidos escisión por RNasa H para aislar RNPs es la capacidad de capturar y analizar el elemento activo en cis ARN RNP sobre RNPs heterogéneos unidos aguas abajo al elemento de RNA que actúan …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de NIH P50GM103297, P30CA100730 y Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
Referências
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