Aqui, descrevemos uma classificação de células de citometria de fluxo combinado e um protocolo de construção de bibliotecas de próxima geração, de baixa entrada, projetado para produzir dados de alta qualidade e total de exomas das células Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) do linfoma de Hodgkin clássico (CHL).
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Artigo de método
Classificação de fluxo e sequenciação Exome das células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células de Hodgkin Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico são distribuídas escassamente em um fundo de linfócitos inflamatórios e tipicamente compreendem menos de 1% da massa tumoral. O material derivado do tumor a granel contém conteúdo de tumor em uma concentração insuficiente para caracterização. Portanto, a classificação de células ativadas por fluorescência usando oito anticorpos, bem como a dispersão lateral e frontal, é descrita aqui como um método de separação e concentração rápida com milhares de células HRS de alta pureza do tumor para estudo posterior. Ao mesmo tempo, porque os protocolos padrão para o sequenciamento exoma tipicamente requerem 100-1000 ng de DNA de entrada, que muitas vezes é muito alto, mesmo com a classificação de fluxo, também fornecemos um protocolo de construção de biblioteca otimizado e de baixa entrada capaz de produzir alta qualidade Dados de até 10 ng de DNA de entrada. Esta combinação é capaz de produzir bibliotecas de próxima geração adequadas para a captura de hibridação de todo o mundoIscas xome ou painéis direcionados focados, conforme desejado. Exome seqüenciamento das células HRS, quando comparado contra células T ou B intratumor saudáveis, pode identificar alterações somáticas, incluindo mutações, inserções e deleções, e alterações no número de cópias. Essas descobertas elucidam a biologia molecular das células HRS e podem revelar vias para tratamentos medicamentosos direcionados.
Introdução
Os avanços na genómica do câncer como resultado da sequenciação da próxima geração levaram a avanços significativos na identificação de alvos terapêuticos e na prognóstico para muitas neoplasias hematológicas e não hematológicas. Novas estratégias de tratamento individualizado baseadas em alterações genômicas específicas estão sendo introduzidas rapidamente em muitos tipos de tumores (revisado nas referências 1 , 2 ). Apesar do progresso significativo na genômica do linfoma, o genoma das células neoplásicas de HRS no linfoma de Hodgkin clássico (CHL) foi subexplorado. As investigações foram prejudicadas....
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Protocolo
1. Processamento e congelamento de tecidos
- Recolher o tecido dos linfonodos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou no meio do Instituto Roswell Park Memorial (RPMI) e processar dentro de 24 h de coleta. Transferir o tecido ganglionar excisado 9 para uma placa de Petri contendo 10 mL de RPMI com 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e picá-lo finamente com uma lâmina de bisturi fresca. Use a parte traseira de um êmbolo de seringa de 10 mL para moer / dissociar o tecido.
- Transfira o líquido para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm. Enxague a placa de Petri e o filtro com 10 mL adicionais de....
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Resultados
Um plano de bioanalyzer deve ser tomado após a ampliação da biblioteca e a limpeza do talão de 0,8x. Deveria ver uma distribuição "normal-like" de tamanhos de fragmentos no intervalo desejado ( Figura 2a ). Desvios dessa forma, como um "ombro" visível na curva, indicam a presença de um artefato de alto ou baixo peso molecular. Por exemplo, a Figura 2b -2d mostra exemplos de bibliotecas que contêm artefactos visí.......
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Discussão
Futuras aplicações ou direções depois de dominar esta técnica
Este trabalho permite a sequenciação exoma de amostras contendo pelo menos 10 ng de DNA. No contexto clínico, este limite exclui a maioria das amostras de aspiração com agulhas finas devido ao material insuficiente, mas inclui biópsias básicas adequadas e amostras de biópsia excisional. Isso permitirá a aquisição de dados de um conjunto maior de possíveis amostras.
Passos críti.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O desenvolvimento deste método de projeto foi financiado pelo Departamento de Patologia e Medicina de Laboratório da Weill Cornell Medical College. Reconhecemos o Programa de Treinamento Tri-Institucional em Biologia Computacional e Medicina para financiamento parcial. Gostaríamos de agradecer aos cientistas que compartilharam seu tempo e conhecimento conosco, especialmente Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; E todos do Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, incluindo Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson e Tuo Zhang.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri ou Cultura de Células (estéril) | |||
| RPMI-1640 Mídia | Roswell Park Memorial Institute | ||
| (FCS), (inativado pelo calor) | |||
| Meios de congelamento (RPMI, 20% FCS, 10% dimetilsulfóxido (DMSO))-faça fresco e mantenha RPMI estéril | |||
| com 2% FCS (faça fresco ou armazene por até 1 mês) | |||
| bisturi com lâmina | |||
| Seringa de 10 mL (sem agulha) | |||
| Frascos criogênicos Tubos | |||
| centrífuga cônicos de 50 mL, centrífuga | |||
| capaz de manusear tubos de centrífuga cônicos de 50 mL e fornecer tampão Hepes de 400g | |||
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | armazenar como 5 mg/mL em RPMI em -200 ° C |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | |||
| Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic – F68 (1x)) | |||
| (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é sugerida | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é | |
| sugerida CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é sugerida | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é | |
| sugerida CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é | |
| sugerida CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μ L sugeriu volume inicial; Titulação é sugerida | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Pode ser substituído por 10 μ L volume sugerido de CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); A titulação é sugerida | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 μ L sugeriu volume inicial; A titulação é sugerida | |
| CD2 (5 μ g; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | Para protocolo opcional; A titulação é sugerida | |
| CD54 (10 μ g; clone 84H10) | Serotec, Oxford, Reino Unido | Para protocolo opcional; A titulação é sugerida | |
| CD58 (10 μ g; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | Para protocolo opcional; A titulação é | |
| sugerida LFA-1 (12 μ g; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | Para protocolo opcional; Titulação é sugerida | |
| BD CS& T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp contas de captura de anticorpos | Beckman Coulter, Miami, FL | Contas de compensação | |
| BD-FACS ARIA instrumento de pedido de pesquisa especial usando 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | qualquer ária BD-FACS com capacidade para detectar os fluorocromos no painel de anticorpos deve ser suficiente | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Kit de ensaio | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternativas podem ser substituídas | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Kit de preparação de biblioteca de baixo rendimento | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq Tecnologias integradas | DNA (IDT), Coralville, Iowa | Purificação de HPLC; AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| Adaptador de índice estilo TruSeq | Tecnologias Integradas de DNA (IDT), Coralville, Iowa | Purificação de HPLC; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| Primer de PCR estilo TruSeq 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| Primer de PCR estilo TruSeq 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD Software FACSDIVA | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA |
Referências
- Abrams, J. National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M.
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Reimpressões e permissões
