Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom
Summary
Her beskriver vi en kombinert flyt-cytometrisk celle sortering og lavinngang, neste generasjons bibliotekskonstruksjonsprotokoll utviklet for å produsere høykvalitets, hel-eksome data fra Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) celler av klassisk Hodgkin lymfom (CHL).
Abstract
Hodgkin Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom er sparsomt fordelt innenfor en bakgrunn av inflammatoriske lymfocytter og omfatter typisk mindre enn 1% av tumormassen. Materiale som er avledet fra bulktumor inneholder tumorinnhold ved en konsentrasjon som er utilstrekkelig for karakterisering. Derfor beskrives fluorescensaktivert cellesortering ved bruk av åtte antistoffer, så vel som side- og fremover-scatter, som en fremgangsmåte for hurtig separering og konsentrering med høy renhet tusenvis av HRS-celler fra svulsten for etterfølgende studie. På samme tid, fordi standardprotokoller for exome-sekvensering vanligvis krever 100-1000 ng av input-DNA, som ofte er for høyt, selv med flyt sortering, gir vi også en optimalisert, lavinnspilt bibliotekskonstruksjonsprotokoll som er i stand til å produsere høy kvalitet Data fra så lite som 10 ng av inngangsd DNA. Denne kombinasjonen er i stand til å produsere neste generasjons biblioteker egnet for hybridiseringsopptak av hel-eXome agn eller mer fokuserte målrettede paneler, som ønsket. Exome sekvensering av HRS-cellene, sammenlignet med sunne intratumor T- eller B-celler, kan identifisere somatiske endringer, inkludert mutasjoner, innføringer og slettelser, og kopieringstallendringer. Disse funnene belyser molekylærbiologien til HRS-celler og kan avsløre veier for målrettede legemiddelbehandlinger.
Introduction
Fremskritt i kreft genomikk som følge av neste generasjons sekvensering har ført til betydelige gjennombrudd i identifisering av terapeutiske mål og i prognostisering for mange hematologiske og ikke-hematologiske neoplasmer. Nye individuelle behandlingsstrategier basert på spesifikke genomiske endringer blir raskt introdusert i mange svulstetyper (gjennomgått i referanser 1 , 2 ). Til tross for signifikant fremgang i lymfom genomikk, hadde genomet av de neoplastiske HRS-cellene i klassisk Hodgkin lymfom (CHL) blitt undersøkt. Undersøkelsene har blitt bremset av mangel på neoplastiske HRS-celler i et reaktivt mikromiljø, noe som gjør det vanskelig å isolere rensede HRS-cellepopulasjoner 3 .
Metoden for isolering av levedyktige HRS-celler fra primære svulster ble utviklet av Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Metoden bruker en åtte-antistoff-cocktail, bestående av CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 og CD64 for å utvetydig identifisere HRS-celler fra en CHL-svulstsuspensjon. Er i stand til å isolere minst 1000 levedyktige HRS-celler fra friske eller frosne cellesuspensjoner fra tumorbiopsier som består av minst 10 7 celler (ca. 10 mg vev). Renheten er større enn 90% ved strømningscytometrisk analyse og anslås å være Minst 80% ved eksome genomisk analyse av ti sammenhengende tilfeller.
Vi har raffinert en strømningscytometrisk celleisolasjonsteknikk som i stor grad har lettet prosessen, noe som muliggjør rask isolasjon av tusenvis av levedyktige HRS-celler fra primære CHL-svulster 7 . Vi har benyttet teknikken til å produsere det som antas å være den første hel-eksome-sekvensen av tumorcellene i primære tilfeller av Hodgkin lymfom. Våre studier demonstrerer thE gjennomførbarhet av høy gjennomstrømming, genomgående studier av individuelle CHL-tilfeller og har allerede ført til identifisering av nye genomiske endringer med potensial til å forklare aspekter ved CHL-patogenese.
Vi videreutviklet en rørledning for å utnytte det ekstraherte DNA for høye gjennomstrømning genomiske studier. For å oppnå pålitelige resultater fra så få som 1000 sorterte HRS-celler (det minste oppnådd fra sekvensielle tilfeller) videreutviklet vi en modifisert neste generasjons DNA-bibliotekskonstruksjonsprosedyre 8 som tillot oss å øke adapterligasjonsvirkningsgraden og å generere DNA-fragmentbiblioteker Uten overdreven amplifisering. Denne metoden tillater analyse av rutinemessige kliniske prøver og påvisning av gjentatte mutasjoner og kromosomale endringer 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremtidige bruksområder eller retninger etter å ha behersket denne teknikken
Dette arbeidet tillater exome-sekvensering fra prøver som inneholder minst 10 ng DNA. I den kliniske sammenhengen utelukker denne grensen de fleste fine nål aspirasjonsprøver på grunn av utilstrekkelig materiale, men det inkluderer tilstrekkelige kjernebiopsier og ekskisjonsbiopsiprøver. Dette vil muliggjøre oppkjøp av data fra et større sett med mulige prøver.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utviklingen av denne prosjektmetoden ble finansiert av Institutt for patologi og laboratoriemedisin fra Weill Cornell Medical College. Vi anerkjenner det tri-institusjonelle opplæringsprogrammet i Computational Biology and Medicine for delvis finansiering. Vi vil gjerne takke forskerne som delte sin tid og kunnskap med oss, spesielt Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Tchad Locklear; Og alle fra Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, inkludert Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson og Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
Referências
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
