Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина
Summary
Здесь мы описываем комбинированную сортировку по проточной цитометрической ячейке и протокол построения библиотеки нижнего уровня следующего поколения, предназначенный для получения высококачественных данных с полным объемом данных из клеток Ходжкина Рида-Штернберга (HRS) классической лимфомы Ходжкина (КХЛ).
Abstract
Клетки Ходжкина Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина редко распределяются на фоне воспалительных лимфоцитов и обычно составляют менее 1% от массы опухоли. Материал, полученный из объемной опухоли, содержит содержание опухоли при концентрации, недостаточной для характеристики. Таким образом, флуоресцентная активированная клеточная сортировка с использованием восьми антител, а также рассеяние на стороне и в прямом направлении описывается здесь как способ быстрого отделения и концентрирования с высокой степенью чистоты тысяч клеток HRS из опухоли для последующего исследования. В то же время, поскольку стандартные протоколы для секвенирования exome обычно требуют 100-1000 нг входной ДНК, которая зачастую слишком высока, даже при сортировке потока, мы также предоставляем оптимизированный протокол построения библиотеки с низким входным потоком, способный производить высококачественные Данные из всего лишь 10 нг входной ДНК. Эта комбинация способна создавать библиотеки следующего поколения, подходящие для захвата гибридизации целых eПриманки для xome или более целенаправленные целевые панели, по желанию. Секвенирование Exome клеток HRS при сравнении с здоровыми внутриутробными T или B клетками может идентифицировать соматические изменения, включая мутации, вставки и делеции, а также изменения количества копий. Эти результаты подтверждают молекулярную биологию клеток HRS и могут выявлять пути для целенаправленного лечения наркотиками.
Introduction
Прогресс в геномике рака в результате секвенирования следующего поколения привел к значительным прорывам в идентификации терапевтических целей и прогнозировании многих гематологических и негематологических новообразований. Новые индивидуальные стратегии лечения, основанные на специфических геномных изменениях, быстро внедряются во многих типах опухолей (см. Ссылки 1 , 2 ). Несмотря на значительный прогресс в геномике лимфомы, геном неопластических клеток HRS в классической лимфоме Ходжкина (КХЛ) был недостаточно изучен. Исследованиям мешала нехватка неопластических клеток HRS в реактивном микроокружении, что затрудняло выделение популяций очищенных клеток HRS 3 .
Метод выделения жизнеспособных клеток HRS из первичных опухолей был разработан Фроммом и др. 4 ,Ref "> 5 , 6. В этом методе используется коктейль с восемью антителами, состоящий из CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 и CD64, для однозначной идентификации клеток HRS из суспензии опухоли CHL. Способны изолировать по меньшей мере 1000 жизнеспособных клеток HRS из свежих или замороженных клеточных суспензий из биопсий опухоли, состоящих из по меньшей мере 10 7 клеток (приблизительно 10 мг ткани). Чистота превышает 90% путем проточного цитометрического анализа и, по оценкам, Менее 80% по геномному анализу экзома в десяти последовательных случаях.
Мы усовершенствовали метод выделения проточной цитометрической клетки, который значительно облегчил процесс, позволяя быстро изолировать тысячи жизнеспособных клеток HRS от первичных опухолей CHL 7 . Мы использовали эту технику для получения того, что считается первой целой экзотической последовательностью опухолевых клеток в первичных случаях лимфомы Ходжкина. Наши исследования демонстрируютE) возможность высокопроизводительных, геномических исследований отдельных случаев КХЛ и уже привели к идентификации новых геномных изменений с возможностью объяснить аспекты патогенеза ХГЛ.
Мы также разработали трубопровод для использования извлеченной ДНК для высокопроизводительных геномных исследований. Чтобы получить достоверные результаты из 1000 отсортированных клеток HRS (минимальный из последовательных случаев), мы также разработали модифицированную процедуру построения библиотеки ДНК следующего поколения 8, которая позволила нам повысить эффективность лигирования адаптера и создать библиотеки фрагментов ДНК Без чрезмерного усиления. Этот метод позволяет анализировать обычные клинические образцы и выявлять повторяющиеся мутации и хромосомные изменения. 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
Эта работа позволяет секвенировать exome из образцов, содержащих по меньшей мере 10 нг ДНК. В клиническом контексте этот предел исключает большинство тонкоигольных аспирационных образцов из-за недос…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка этого метода проекта финансировалась Департаментом патологии и лабораторной медицины медицинского колледжа Вайля Корнелла. Мы признаем трехуровневую программу обучения в области вычислительной биологии и медицины для частичного финансирования. Мы хотели бы поблагодарить ученых, которые делились своим временем и знаниями с нами, особенно с Маркеем Аппелем; Дэн Берджесс; Иванка Козарева; Чад Локлир; И всех из Медицинского Колледжа Уэлла Корнелла, Геномического Главного Фонда, в том числе Дженни Чжан, Сяобо (Шон) Лян, Донг Сюй, Вэй Чжан, Хуйминь Шан, Татьяна Бэтсон и Туо Чжан.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
Referências
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
