Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Nematoder med sine små, men komplekse nervesystem har vist kraftige verktøy for å forstå mange aspekter av nevrobiologi, inkludert atferd. Mye av denne forskningen har fokusert på modellorganisme Caenorhabditis elegans hvor et vell av ulike atferd har blitt dissekert og analysert. Disse inkluderer mechanosensory 3, kjemotaktisk 4, thermotactic 5,6 og magnetotactic 7 påvirke parring 8,9, læring 10 og fôring atferd 11. Men andre mer fjernt beslektede nematode arter vise atferd som ikke er observert i rhabditid C. elegans eller alternativt vise flere nivåer av kompleksitet, som reiser relevante spørsmål angående deres utvikling og regulering. Ett slikt eksempel på dette kan observeres i den fjernt beslektet diplogastrid nematode Pristionchus pacificus, som viser mye mer kompleks foring blihaviors og rytmer enn det som er observert i C. elegans en. Dette er til tross for de to artene dele homologe svelget nevroner 12. Samtidig med disse ekstra fôring atferd, P. pacificus viser også en utvidet kosttilskudd utvalg, som de er ivrige rovdyr, i stand til å supplere sitt bakteriell kosthold ved også å mate på larver av andre nematoder. Heldigvis P. pacificus har blitt utviklet som en modell for komparativ og integrerende evolusjonsbiologi og derfor mange molekylære og genetiske verktøy er nå tilgjengelig. Disse inkluderer en fullt sekvensert og annotert genom 13, molekylære og genetiske verktøy, inkludert transgener 14 og CRISPR / Cas9 15,16 samt en detaljert og godt merket fylogeni 17 med over 25 nært beslektede arter, inkludert sine nyoppdagede søsterarter. I tillegg økologien i tallrike Pristionchus arter inklusive P. pacificus er vill definert med mange arter vi nå er blitt beskrevet dele en necromenic tilknytning skarabé biller, en rekke de ofte dele med andre nematode arter 18. P. pacificus gir derfor et utmerket modellsystem som å dissekere utviklingen av nye atferd og deres økologiske betydning.
For å analysere rov forings atferd i nematode arter som P. pacificus vi utviklet flere nye atferdsanalyser for enkel observasjon og kvantifisering av rov handlinger. Som P. pacificus viser en dimorphic munn struktur, som sterkt påvirker aggressiv adferd, identifisering av riktig morphotype er viktig 1,2. Den smale kjeften stenostomatous morph inneholder en enkelt sløv rygg tann og engasjerer seg ikke i noen rov fôring. Alternativt omfatter det brede kjeften eurystomatous morph en mye større klo formet rygg tann og en ekstra motstridsub-ventral tann, som sammen operere effektivt åpne skjellaget av deres byttedyr. Forholdet mellom rov eurystomatous til den ikke-rov stenostomatous formen varierer mellom Pristionchus arter og også innen P. pacificus imidlertid andelen eurystomatous munn morph i P. pacificus vill type belastning (PS312) er vanligvis 70-90% 2. I tillegg kan de munn skjema forholdene varierer avhengig av ulike miljøpåvirkninger (begge kjent, inkludert sult og noen små molekyl signalering samt ukjente faktorer), og dermed korrekt identifisering og isolering av rov eurystomatous munnen form er avgjørende for vellykkede rov analyser.
Ved siden av beskrivelsen av rov munnen skjemaet har vi utviklet en "bite analysen" for direkte observasjon og kvantifisering av rov atferd inkludert biting, drap og fôring hendelser. Her byttedyr nematoder er isolert gjennom filtering av nylig sultet kulturer og utsatt for rov voksen P. pacificus, som er observert sammen over et kort tidsrom. I tillegg har vi også utviklet en høy gjennomstrømming "liket analysen" for å legge til rette for rask screening av aggressiv adferd gjennom indirekte observasjon av rov hendelser. Dette utnyttet nærvær av larver likene som et verktøy for å screene for predasjon. Begge analysene gir enkel og svært repeterbare metoder for å observere og måle aggressiv adferd i nematode arter som P. pacificus.
Nematoder gi et kraftig system for å forstå nevrobiologi og atferd med C. elegans så langt å være det viktigste verktøyet. Men, mange nematode arter inkludert P. Pacificus vise atferd som er fraværende eller varierer i kompleksitet fra modellorganisme C. elegans og derfor øke fascinerende spørsmål om utviklingen og reguleringen av disse atferd. En slik ytterligere oppførsel finnes i mange andre nematoder arter, inkludert P. pacificus er evnen til å supplere sine bakteriell diett ved å delta i rov fôring 1, 20. Derfor har vi utviklet og beskrevet en detaljert protokoll for enkel og rask karakterisering av disse tidligere unanalyzed rov atferd i nematoder.
For det første har vi gitt metoder for å screene for variasjoner i fôring apparat i nematode munnen. Identifiseringen av riktig munnen typen er et viktig første sTep for vellykkede predasjon analyser som, i hvert fall innenfor Pristionchus slekten bare eurystomatous dyr er i stand til rov fôring. Det er best å identifisere munn forvandles med den "raske munn fenotyping" protokoll beskrevet i protokollen 1,2 da denne metoden er mye mindre invasiv og det er derfor mindre sannsynlig at rov oppførsel kan bli forstyrret. Imidlertid er det anbefalt å først bli kjent med de forskjellige munnen strukturer ved identifikasjon med bedøvede dyr på agar pads (protokoll 1.1).
Etter identifisering av den ønskede munnen morph, har vi beskrevet to analyser for å kvantifisere rov fôring. Dette er en rask, høy gjennomstrømning "liket assay" (protokoll 3) og en mer tidkrevende, men mer dyptgående adferdsanalyse gjennom "bite analysen" (protokoll 2). Begge disse protokollene er meget fleksible slik at flere modifikasjoner for å optimalisere analysene avhengig av experimental krav. For bite analyser ved hjelp av P. Pacificus rovdyr på C. elegans byttedyr, observasjoner av rov atferds interaksjoner for et tidsvindu på 10 minutter var nok til å kvantifisere en betydelig mengde biter sammen med andre fôring hendelser. For "liket analyser" igjen utnytte P. Pacificus rovdyr på C. elegans byttedyr, 5 rovdyr i 2 timer produsert lett kvantifiserbare og konsistente liket tall som åpner for rask atferdsanalyse. Imidlertid bør det bemerkes forskjellige arter av rovfisk nematode trekk ved ulike hastigheter, spise på ulike priser og generelt viser et stort mangfold i andre atferd 1. I tillegg kan ulike byttedyr også spises på ulike priser for lignende grunner. Det anbefales derfor å optimalisere analyser basert på de nematode arter testet både som rovdyr og byttedyr, og også for eventuelle forskjeller i miljøforhold. Under både "bite" og "korpse "analyser er det avgjørende at både byttedyr og rovdyr er sunt, som stresset eller skadet rovdyr vil ikke drepe effektivt. I tillegg ferske analyseplatene er viktig som eldre plater kan bli tørket ut som negativt påvirker helsen til nematoder som fører til feilaktige analyser. det er også å håpe at fremtidige gjentakelser av disse rov analyser vil kunne dra nytte av nylige fremskritt innen teknologi for å automatisere mye av analysen som er gjort for å undersøke mange atferd observert i C. elegans 21, 22. Foreløpig problemer er sannsynlig å oppstå i nematoder som P. pacificus som de dukker opp mye mer sensitiv for berøring, noe som gjør isolasjon og immobilisering i microfluidic kamre sannsynlig å oppheve rov fôring. Vinne dette kan vise seg utfordrende, men ville lette enkelte nematoder å bli vist for subtil rov atferd.
Endelig har vi også gitt metoder for undersøke nematode mateapparatet selv tilrettelegge sammenligninger mellom rov og bakterie fôring modusene ved å tallfeste tann og svelget pumpekinetikk ved hjelp av et høyhastighetskamera (protokoll 4). Kvantifisering av svelget pumpeprisene i C. elegans har vært benyttet for å overvåke mating i mange år 23, derimot, C. elegans mangler noen form for munnen denticle og mangler også rov atferd. Gjennom å kombinere kvantifisering av svelget pumping med at av tann aktivitet, kan noen innervasjon av tennene som er spesifikke for predasjon også observeres. På grunn av forstørrelsen som kreves for å observere den tann bevegelse dyrene ofte beveger seg ut av brennplanet, og dermed er det vanligvis bare mulig å observere den tann for korte tidsvinduer. I tillegg, i motsetning til C. elegans, svelget av P. pacificus ikke kontinuerlig pumpe, snarere det engasjerer seg i staver av pumping og mating. Derfor, for nøyaktig svelget pumping priser mens fôring skal fastsettes, er det viktig å ta opp 15 sekunder av kontinuerlig fôring.
Disse metodene som presenteres her gir derfor den første rammeverk for å undersøke rov atferd i nematode systemer. Videre kan de også være tilpasningsdyktig for bruk i å undersøke andre interaksjoner innen nematode økosystemet inkludert påvirkning av tillegg økologisk relevante organismer på predasjon inkludert mikroorganismer, sopp og midd . Dermed gir de et middel til å dissekere hvordan disse rov atferd er regulert, hvordan de kan ha utviklet seg, og også deres økologiske betydning.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |