Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Nematoder med sina små men komplexa nervsystem har visat sig vara kraftfulla verktyg för att förstå många aspekter för neurobiologi, inklusive beteende. En stor del av denna forskning har fokuserat på modellorganism Caenorhabditis elegans i vilka en mängd olika beteenden har framgångsrikt dissekeras och analyserats. Dessa inkluderar mechanosensory 3, kemotaktisk 4, thermotactic 5,6 och magnetotactic 7 påverka parning 8,9, lärande 10 och utfodring beteenden 11. Men andra mer avlägset besläktade nematoden arter uppvisar beteenden som inte observeras i rhabditid C. elegans eller alternativt visa ytterligare nivåer av komplexitet, vilket väcker relevanta frågor om deras utveckling och reglering. Ett sådant exempel på detta kan observeras i avlägset besläktade diplogastrid nematod Pristionchus pacificus, som visar mycket mer komplex utfodring varahaviors och rytmer än vad som observerats i C. elegans 1. Detta trots de två arterna dela homologa svalget neuroner 12. Sammanfaller med dessa ytterligare utfodring beteenden, P. pacificus visar också ett utökat kost intervall, eftersom de är ivrig rovdjur, kan komplettera deras bakterie diet genom att också livnär sig på larver av andra nematoder. Lyckligtvis P. pacificus har utvecklats som en modell för jämförande och integrerande evolutionsbiologi och därmed många molekylära och genetiska verktyg finns nu tillgängliga. Dessa inkluderar ett fullt sekvenseras och kommenterad genomet 13, molekylära och genetiska verktyg, inklusive transgener 14 och crispr / Cas9 15,16 samt en detaljerad och väl kommenterad fylogeni 17 med över 25 närbesläktade arter, inklusive dess nyupptäckta systerarter. Dessutom ekologi talrika Pristionchus arter inklusive P. pacificus är vill definieras med många arter har nu beskrivits dela en necromenic förening med scarabskalbaggar, en värd de ofta dela med andra nematoder arter 18. P. pacificus ger därför ett utmärkt modellsystem som att dissekera utvecklingen av nya beteenden och deras ekologiska betydelse.
För att analysera rovdjur utfodring beteenden i nematoder arter såsom P. pacificus vi utvecklat flera nya beteendemässiga analyser för enkel observation och kvantifiering av underprissättning åtgärder. Som P. pacificus visar en dimorphic mun struktur, som starkt påverkar underprissättning, identifiering av den korrekta morphotype är viktigt 1,2. Den smala mun stenostomatous morph innehåller en enda trubbig rygg tand och inte utöva någon underprissättning utfodring. Alternativt inkluderar stor öppning eurystomatous morph en mycket större klo formad dorsala tand och en ytterligare motståendesub-ventrala tand, som tillsammans verkar för att effektivt öppna nagelbanden av sitt byte. Förhållandet mellan den predatory eurystomatous till den icke-predatory stenostomatous formen varierar bland Pristionchus arter och även inom P. pacificus dock andelen eurystomatous mun morph i P. pacificus vildtyp stam (PS312) är vanligtvis 70-90% 2. Dessutom kan munnen bildar förhållandena fluktuerar olika miljöpåverkan (båda kända, inklusive svält och några små signalmolekyl liksom okända faktorer), vilket korrekt identifiering och isolering av rovgiriga eurystomatous munnen formen är en förutsättning för framgångsrika rovdjur analyser.
Vid sidan av beskrivningen av rovdjur munnen formen har vi utvecklat en "bite analys" för direkt observation och kvantifiering av rovdjurs beteenden inklusive bitande, döda och utfodring händelser. Här bytes nematoder isoleras genom filtreringning av nya svalt kulturer och exponeras för aggressiv vuxen P. pacificus, som observeras tillsammans under en kort tidsrymd. Dessutom har vi också utvecklat en hög genomströmning "lik analys" för att underlätta snabb screening av underprissättning genom indirekt observation av rovdjurs händelser. Detta drar fördel av närvaron av larv lik som ett verktyg för att screena för predation. Båda analyserna ger en enkel och mycket repeterbara metoder för observation och mätning av underprissättning i nematoder arter såsom P. pacificus.
Nematoder ge ett kraftfullt system för att förstå neurobiologi och beteende med C. elegans hittills är det viktigaste verktyget. Men många nematoder arter, inklusive P. pacificus visa beteenden som är frånvarande eller varierar i komplexitet från modellorganism C. elegans och därmed höja fascinerande frågor om utveckling och reglering av dessa beteenden. En sådan ytterligare beteenden som finns i många andra nematoder arter, inklusive P. pacificus är förmågan att komplettera sin bakterie kost genom att delta i rovdjurs utfodring ett 20. Därför har vi utvecklat och beskrivit ett detaljerat protokoll för enkel och snabb karaktärisering av dessa tidigare oanalyserade rovdjurs beteenden i nematoder.
För det första har vi tillhandahållit metoder för att screena för variationer i matningsanordningen i nematoden munnen. Identifieringen av rätt mun typ är ett viktigt första sTep för framgångsrika predation analyser som, åtminstone inom Pristionchus släktet endast eurystomatous djur klarar av underprissättning utfodring. Det är bäst att identifiera munnen morfar med "snabba mun fenotypning" protokoll som beskrivs i protokoll 1,2 eftersom denna metod är mycket mindre invasiv och därför är det mindre troligt att rovdjurs beteenden kan störas. Det är dock rekommenderas att först bekanta sig med de olika mun strukturer genom identifiering med bedövade djur på agar kuddar (protokoll 1,1).
Efter identifiering av den önskade munnen morf, har vi beskrivit två analyser för att kvantifiera predatory utfodring. Dessa är en snabb, hög genomströmning "lik analys" (protokoll 3) och en mer tidskrävande men mer djupgående beteendeanalys genom "bita analys" (protokoll 2). Båda dessa protokoll är mycket flexibla vilket möjliggör flera modifieringar för att optimera analyserna beroende på experimenTal krav. För bett analyser med användning av P. pacificus rovdjur på C. elegans rov, observationer av predatory beteende interaktioner för ett tidsfönster på 10 min var tillräcklig för att kvantifiera en betydande mängd av bites tillsammans med andra händelser utfodrings. För "liket analyser" igen utnyttjar P. pacificus rovdjur på C. elegans byte, 5 rovdjur under 2 timmar producerade lätt kvantifierbara och konsekventa liket nummer som möjliggör snabb beteendeanalys. Emellertid bör det noteras olika arter av predatory nematod rör sig med olika hastigheter, äta i olika takt och allmänt uppvisar en stor mångfald i andra beteenden 1. Dessutom kan olika bytesdjur också ätas i olika takt för liknande skäl. Det rekommenderas därför att optimera analyser baserade på nematoden arter testade både rovdjur och bytesdjur, och även för eventuella skillnader i miljöförhållanden. Under både "bite" och "corpse "analyser är det viktigt att både byte och rovdjur är friska, så stressade eller skadade rovdjur kommer inte döda effektivt. Dessutom färska analysplattor är viktigt eftersom äldre plattor kan bli uttorkad vilket negativt påverkar hälsan hos de nematoder som leder till felaktiga analyser. Förhoppningen är också att framtida iterationer av dessa rovdjurs analyser kommer att kunna dra nytta av de senaste framstegen inom teknik för att automatisera mycket av analysen som har åstadkommits för att undersöka många beteenden som observerats i C. elegans 21, 22. för närvarande problem kommer sannolikt att uppstå i nematoder såsom P. pacificus eftersom de verkar mycket mer känsliga för kontakt, vilket gör isolering och immobilisering i mikroflödeskammare som kan upphäva rovdjurs matning. att övervinna detta kan vara utmanande men skulle underlätta enskilda nematoder som ska screenas för subtilare underprissättning beteenden.
Slutligen har vi också metoder for undersöka nematoden matningsanordningen själv underlätta jämförelser mellan rovdjur och bakterieutfodringslägen genom att kvantifiera tand och svalgpump kinetik med hjälp av en höghastighetskamera (protokoll 4). Kvantifiering av svalgpumphastigheter i C. elegans har använts för att övervaka utfodring under många år 23 dock C. elegans saknar varje form av mun LITEN TAND och även saknar underprissättning beteenden. Genom att kombinera kvantifieringen av svalget pumpa med den för tand aktivitet kan någon innervation av tänderna som är specifika för predation kan också observeras. På grund av förstoringen som krävs för att följa tandrörelsen djuren rör sig ofta av fokalplanet, det är därför oftast bara möjligt att observera tand för korta tidsfönster. Dessutom, till skillnad C. elegans, svalget av P. pacificus inte kontinuerligt pumpa, snarare bedriver perioder av pumpning och utfodring. Därför, för noggrann svalg pumping takt medan utfodring som skall bestämmas, är det viktigt att spela in 15 sek av kontinuerlig matning.
Dessa metoder presenteras här ger därför den första ramen för att utreda rovdjur beteenden i nematod system. Dessutom, de kan också vara anpassningsbar för användning vid undersökning övriga interaktioner inom nematoden ekosystemet inklusive påverkan av ytterligare ekologiskt relevanta organismer predation inklusive mikroorganismer, svampar och kvalster . Således ger de en möjlighet att dissekera hur dessa rovgiriga beteenden regleras, hur de kan ha utvecklats och även deras ekologiska betydelse.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |